Saber exactamente cuánta proteína hay en una muestra — antes de correr un gel, montar un ensayo enzimático o normalizar un Western blot — es una de las mediciones más rutinarias en un laboratorio de bioquímica o biología molecular. La espectrofotometría UV a 280 nm hace esto rápido y no destructivo, pero obtener un número preciso depende de elegir el coeficiente de extinción correcto y entender qué está midiendo realmente la ley de Beer-Lambert.
Por qué A280 mide la concentración de proteína
Las proteínas absorben luz ultravioleta con mayor intensidad alrededor de los 280 nanómetros debido a las cadenas laterales aromáticas del triptófano y la tirosina (y, más débilmente, la fenilalanina y los enlaces disulfuro). Bajo la ley de Beer-Lambert, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración para una longitud de paso fija, así que medir A280 permite calcular la concentración una vez que conoces el coeficiente de extinción de la muestra — la constante de proporcionalidad que vincula la absorbancia con la cantidad de proteína realmente presente.
Coeficientes de extinción molares vs. de masa
Los coeficientes de extinción de proteínas se publican en dos convenciones distintas. Un coeficiente de extinción molar (ε_M, en M⁻¹cm⁻¹) describe la absorbancia por mol de proteína y requiere el peso molecular de la proteína para convertir el resultado en concentración de masa (mg/mL). Un coeficiente de extinción de masa (a menudo etiquetado como ε(0.1%) o E1%₂₈₀, en (mg/mL)⁻¹cm⁻¹) describe la absorbancia por unidad de concentración de masa directamente, saltándose por completo el paso del peso molecular. Confundir las dos convenciones — usar un valor molar en una fórmula basada en masa o viceversa — es una de las fuentes más comunes de error de un orden de magnitud en la cuantificación de proteínas.
Por qué un coeficiente de extinción teórico puede estar equivocado
Los coeficientes de extinción molares generalmente se calculan de forma teórica a partir de la secuencia de aminoácidos de una proteína — contando residuos de triptófano, tirosina y cistina (cisteína unida por disulfuro) y sumando sus contribuciones conocidas por residuo. Esto funciona bien para la mayoría de las proteínas solubles bien plegadas, pero puede subestimar o sobreestimar la absorbancia en proteínas con plegamiento inusual, cofactores unidos o pocos residuos aromáticos. Las etiquetas de fusión, los desnaturalizantes y el pH también pueden desplazar el coeficiente de extinción real respecto al valor teórico.
Cuándo usar una curva estándar en su lugar
Los ensayos colorimétricos como Bradford (unión de colorante Coomassie) y BCA (ácido bicinconínico, reducción de cobre) no dependen en absoluto de la absorbancia UV propia de la proteína — miden un cambio de color proporcional a la masa total de proteína, calibrado contra una curva estándar construida con concentraciones conocidas de una proteína de referencia, generalmente albúmina de suero bovino (BSA). Estos métodos son menos sensibles a la composición específica de aminoácidos de una proteína que A280, lo que los convierte en una buena verificación cruzada — o el método principal — para proteínas con pocos residuos de triptófano/tirosina, o para lisados crudos que contienen muchas proteínas distintas a la vez.
Limitaciones de las estimaciones basadas en A280
Las lecturas de A280 son rápidas, pero asumen que la muestra está libre de otros contaminantes que absorben UV — los ácidos nucleicos en particular absorben fuertemente a 260 nm y pueden filtrarse en la lectura de 280 nm, inflando la concentración aparente de proteína. Las muestras turbias o particuladas dispersan la luz y también inflan la lectura. Para la cuantificación más rigurosa, verifica cruzadamente una estimación basada en A280 con un ensayo colorimétrico (Bradford/BCA) o, cuando la precisión absoluta importa más, con un análisis de aminoácidos.