Calculadora de Concentración de Proteínas

calcular concentración de proteína a partir de una lectura de absorbancia A280 y el coeficiente de extinción (Beer-Lambert), o de un método de curva estándar.

Convierta una lectura de absorbancia UV-Vis A280 en una concentración de proteína usando la ley de Beer-Lambert: C = A280 / (ε × l). Elija un coeficiente de extinción molar (necesita peso molecular) o uno basado en masa (no lo necesita).

Lectura A280

Absorbancia a 280 nm (sin unidades).

Extinction coefficient unidades

Coeficiente de extinción (ε)

p.e. BSA ε280 ≈ 43,824 M⁻¹cm⁻¹.

Molecular peso (Da)

p.ej. BSA ≈ 66.500 Da. Requerido para molar ε.

Path longitud (cm)

La longitud del recorrido estándar de la cubeta es de 1 cm.

Factor de dilución

1 si se lee la muestra sin diluir.

Resultado

—

Introduzca valores para calcular.

Concentración—

Molar (μM)—

Como-read (no scaling)—

6 min de lectura 3 pasos 7 términos 3 ejemplos 6 preguntas frecuentes C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × l)] × MW

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Paso a paso

Cómo usar esta calculadora

3 pasos

Elige un modo e ingresa tu lectura

En la pestaña Desde A280, ingresa la lectura de absorbancia A280 de tu espectrofotómetro, elige si tu coeficiente de extinción es molar (M⁻¹cm⁻¹, necesita un peso molecular) o basado en masa ((mg/mL)⁻¹cm⁻¹, no necesita peso molecular), e ingresa el valor del coeficiente y la longitud de paso de la cubeta (1 cm para la mayoría de los instrumentos). Si trabajas a partir de una curva estándar de Bradford o BCA, cambia a la pestaña Curva Estándar e ingresa la pendiente y la intersección de la curva junto con la absorbancia de tu muestra.

Lee la concentración en mg/mL y µM

La tarjeta de resultados muestra la concentración de proteína en mg/mL junto con una interpretación en lenguaje sencillo. Siempre que haya un peso molecular disponible (siempre en modo molar, opcionalmente en modo de masa si también ingresas uno), también se muestra la concentración molar en µM — útil para cálculos de estequiometría o unión.

Usa la pestaña Dilución para muestras diluidas

Si tu muestra estaba demasiado concentrada para leerla directamente, dilúyela, lee el A280 diluido y luego usa la pestaña Dilución para escalar esa lectura de vuelta a la concentración del stock original. Reporta tanto el valor tal como se leyó (lo que literalmente hay en la cubeta) como la concentración del stock escalada. Todo se actualiza al instante — no hay botón de calcular.

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Referencia

Fórmula y metodología

4 fórmulas

Concentración a partir de A280 (coeficiente de extinción molar)

C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × l)] × MW

La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia es proporcional a la concentración y a la longitud de paso: A = ε × l × c. Despejando la concentración molar se obtiene c (mol/L) = A280 / (ε_M × l), donde ε_M es el coeficiente de extinción molar en M⁻¹cm⁻¹ y l es la longitud de paso en cm (1 cm para una cubeta estándar). Multiplicar la concentración molar por el peso molecular de la proteína (MW, en g/mol o Da) convierte mol/L en g/L, que es numéricamente idéntico a mg/mL — no se necesita ninguna conversión de unidades adicional.

Concentración a partir de A280 (coeficiente de extinción de masa)

C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × l)

Algunos coeficientes de extinción publicados — a menudo etiquetados como ε(0.1%) o E1%₂₈₀ — ya se expresan en base de masa, en unidades de (mg/mL)⁻¹cm⁻¹. En ese caso, la concentración en masa se obtiene directamente de la ley de Beer-Lambert sin necesitar peso molecular: C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × l). Aun así, se puede proporcionar un peso molecular después para reportar adicionalmente una concentración molar (µM).

Curva estándar

C = (A − intercept) / slope

Una curva estándar (comúnmente construida con un ensayo Bradford o BCA y concentraciones conocidas de BSA) ajusta una línea recta, absorbancia = pendiente × concentración + intersección, a un conjunto de estándares de concentración conocida. Una vez ajustada, la concentración de una muestra desconocida se lee de la línea despejando la concentración a partir de su absorbancia medida.

Escalado por dilución

C_stock = C_as-read × dilution factor

Cuando una muestra se diluye antes de leerla — necesario una vez que la absorbancia sube por encima de aproximadamente 1.0–1.5, donde la linealidad del espectrofotómetro se rompe — la concentración calculada a partir de la lectura diluida solo describe la muestra diluida. Multiplicar por el factor de dilución (por ejemplo, 10 para una dilución 1:10) recupera la concentración del stock original sin diluir.

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Glosario

Términos clave explicados

7 términos

Concentración de proteína La cantidad de proteína disuelta en un volumen dado de solución, expresada más comúnmente en mg/mL (concentración de masa) o µM/mol por litro (concentración molar).

A280 La absorbancia de una muestra a una longitud de onda de 280 nanómetros, el punto donde los aminoácidos aromáticos triptófano, tirosina y (débilmente) fenilalanina absorben luz UV. Es la medición estándar, rápida y no destructiva usada para estimar la concentración de proteína.

Coeficiente de extinción Una constante de proporcionalidad (ε) que describe qué tan fuertemente una sustancia absorbe luz a una longitud de onda dada. Para proteínas puede expresarse en base molar (M⁻¹cm⁻¹, requiere un peso molecular para obtener una concentración de masa) o en base de masa ((mg/mL)⁻¹cm⁻¹, da la concentración de masa directamente).

Ley de Beer-Lambert La ley física que establece que la absorbancia es directamente proporcional tanto a la concentración como a la longitud de paso: A = ε × l × c. Subyace a toda estimación espectrofotométrica de concentración, incluyendo la cuantificación de proteínas basada en A280.

Concentración molar vs. de masa La concentración molar (mol/L, o µM en niveles bajos) cuenta moléculas de proteína sin importar su tamaño; la concentración de masa (mg/mL) pesa la masa total de proteína. Convertir entre ambas requiere el peso molecular de la proteína: masa = molar × MW.

Curva estándar Una línea de calibración construida midiendo la absorbancia de varias muestras de concentración de proteína conocida (a menudo BSA), y luego ajustando una línea (absorbancia vs. concentración) usada para leer la concentración de muestras desconocidas a partir de su absorbancia medida.

NanoDrop Una marca común de espectrofotómetro de microvolumen usado en laboratorios de biología molecular y bioquímica para medir A280 y derivar la concentración de proteína a partir de tan solo 1–2 µL de muestra sin una cubeta tradicional.

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Escenarios

Ejemplos del mundo real

3 ejemplos

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Cuantificando una preparación purificada de lisozima

A280 con un coeficiente de extinción molar

Lectura de A280 0.5 Coeficiente de extinción (molar) 36000 M⁻¹cm⁻¹ Peso molecular 14300 Da

C = [0.5 / (36,000 × 1)] × 14,300 ≈ 0.199 mg/mL (≈13.9 µM). El coeficiente de extinción bien caracterizado de la lisozima hace que A280 sea una forma rápida y confiable de verificar el rendimiento tras la purificación.

🧪

Leyendo una muestra desconocida contra una curva estándar de BSA

Curva estándar (ensayo Bradford/BCA)

Pendiente 1.2 Intersección 0.05 Absorbancia (desconocida) 0.65

C = (0.65 − 0.05) / 1.2 = 0.5 mg/mL. Los ensayos Bradford y BCA no dependen del contenido de triptófano/tirosina, por lo que una curva estándar suele preferirse para proteínas con una composición de aminoácidos inusual.

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Leyendo una preparación concentrada de anticuerpo tras dilución

Escalando una lectura de A280 diluida

Lectura de A280 (diluida) 0.4 Coeficiente de extinción (molar) 43824 M⁻¹cm⁻¹ Peso molecular 66500 Da Factor de dilución 10

La muestra diluida en sí se lee como ≈0.607 mg/mL; se leyó una dilución 1:10 para mantenerse dentro del rango lineal del instrumento, así que escalando por el factor de dilución se muestra que el stock sin diluir es ≈6.07 mg/mL.

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Referencia

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Análisis a fondo

Cómo Calcular la Concentración de Proteína a partir de una Lectura de A280

5 capítulos · 6 min de lectura

Saber exactamente cuánta proteína hay en una muestra — antes de correr un gel, montar un ensayo enzimático o normalizar un Western blot — es una de las mediciones más rutinarias en un laboratorio de bioquímica o biología molecular. La espectrofotometría UV a 280 nm hace esto rápido y no destructivo, pero obtener un número preciso depende de elegir el coeficiente de extinción correcto y entender qué está midiendo realmente la ley de Beer-Lambert.

Por qué A280 mide la concentración de proteína

Las proteínas absorben luz ultravioleta con mayor intensidad alrededor de los 280 nanómetros debido a las cadenas laterales aromáticas del triptófano y la tirosina (y, más débilmente, la fenilalanina y los enlaces disulfuro). Bajo la ley de Beer-Lambert, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración para una longitud de paso fija, así que medir A280 permite calcular la concentración una vez que conoces el coeficiente de extinción de la muestra — la constante de proporcionalidad que vincula la absorbancia con la cantidad de proteína realmente presente.

Coeficientes de extinción molares vs. de masa

Los coeficientes de extinción de proteínas se publican en dos convenciones distintas. Un coeficiente de extinción molar (ε_M, en M⁻¹cm⁻¹) describe la absorbancia por mol de proteína y requiere el peso molecular de la proteína para convertir el resultado en concentración de masa (mg/mL). Un coeficiente de extinción de masa (a menudo etiquetado como ε(0.1%) o E1%₂₈₀, en (mg/mL)⁻¹cm⁻¹) describe la absorbancia por unidad de concentración de masa directamente, saltándose por completo el paso del peso molecular. Confundir las dos convenciones — usar un valor molar en una fórmula basada en masa o viceversa — es una de las fuentes más comunes de error de un orden de magnitud en la cuantificación de proteínas.

Por qué un coeficiente de extinción teórico puede estar equivocado

Los coeficientes de extinción molares generalmente se calculan de forma teórica a partir de la secuencia de aminoácidos de una proteína — contando residuos de triptófano, tirosina y cistina (cisteína unida por disulfuro) y sumando sus contribuciones conocidas por residuo. Esto funciona bien para la mayoría de las proteínas solubles bien plegadas, pero puede subestimar o sobreestimar la absorbancia en proteínas con plegamiento inusual, cofactores unidos o pocos residuos aromáticos. Las etiquetas de fusión, los desnaturalizantes y el pH también pueden desplazar el coeficiente de extinción real respecto al valor teórico.

Cuándo usar una curva estándar en su lugar

Los ensayos colorimétricos como Bradford (unión de colorante Coomassie) y BCA (ácido bicinconínico, reducción de cobre) no dependen en absoluto de la absorbancia UV propia de la proteína — miden un cambio de color proporcional a la masa total de proteína, calibrado contra una curva estándar construida con concentraciones conocidas de una proteína de referencia, generalmente albúmina de suero bovino (BSA). Estos métodos son menos sensibles a la composición específica de aminoácidos de una proteína que A280, lo que los convierte en una buena verificación cruzada — o el método principal — para proteínas con pocos residuos de triptófano/tirosina, o para lisados crudos que contienen muchas proteínas distintas a la vez.

Limitaciones de las estimaciones basadas en A280

Las lecturas de A280 son rápidas, pero asumen que la muestra está libre de otros contaminantes que absorben UV — los ácidos nucleicos en particular absorben fuertemente a 260 nm y pueden filtrarse en la lectura de 280 nm, inflando la concentración aparente de proteína. Las muestras turbias o particuladas dispersan la luz y también inflan la lectura. Para la cuantificación más rigurosa, verifica cruzadamente una estimación basada en A280 con un ensayo colorimétrico (Bradford/BCA) o, cuando la precisión absoluta importa más, con un análisis de aminoácidos.

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Preguntas

Preguntas frecuentes

6 preguntas

¿Cuál es la fórmula para la concentración de proteína a partir de A280?+

Usando un coeficiente de extinción molar: C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × longitud de paso)] × peso molecular. Usando un coeficiente de extinción basado en masa (sin necesitar peso molecular): C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × longitud de paso). Ambas provienen de la ley de Beer-Lambert, A = ε × l × c.

¿Por qué A280 mide la concentración de proteína?+

Los aminoácidos aromáticos triptófano y tirosina (y, más débilmente, la fenilalanina y los enlaces cistina/disulfuro) absorben luz ultravioleta con mayor intensidad alrededor de los 280 nanómetros. Como la absorbancia es proporcional a la concentración bajo la ley de Beer-Lambert, medir A280 permite estimar cuánta proteína está presente.

¿Cuál es la diferencia entre un coeficiente de extinción molar y uno de masa?+

Un coeficiente de extinción molar (M⁻¹cm⁻¹) es la absorbancia por mol de proteína y necesita el peso molecular para convertirse en concentración de masa. Un coeficiente de extinción de masa ((mg/mL)⁻¹cm⁻¹, a veces publicado como ε(0.1%) o E1%₂₈₀) es la absorbancia por unidad de concentración de masa y da mg/mL directamente, sin necesitar peso molecular.

¿Qué es una curva estándar y cuándo debería usar una?+

Una curva estándar es una línea de calibración construida a partir de la absorbancia medida de varias muestras con concentración de proteína conocida (comúnmente BSA en un ensayo Bradford o BCA). Es útil cuando no conoces el coeficiente de extinción de tu proteína, o cuando trabajas con una mezcla de proteínas (como un lisado celular crudo) donde no aplica un único coeficiente de extinción.

¿Qué unidades usa esta calculadora?+

A280 y la absorbancia de la curva estándar no tienen unidades. La concentración de masa se reporta en mg/mL. La concentración molar, mostrada siempre que haya un peso molecular disponible, se reporta en µM (micromolar). El peso molecular se ingresa en Daltons (Da), numéricamente igual a g/mol.

¿Cómo uso el factor de dilución?+

Si la absorbancia de tu muestra es demasiado alta para leerla con precisión (típicamente por encima de un A280 de aproximadamente 1.0–1.5), dilúyela antes de leerla y luego ingresa el factor de dilución — por ejemplo, 10 para una dilución 1:10 — en la pestaña Desde A280 o Dilución. La calculadora multiplica la concentración de la lectura diluida por el factor de dilución para reportar la concentración del stock original sin diluir.

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