Lograr que una ligación de clonación funcione de forma confiable comienza por agregar la cantidad molar correcta de inserto en relación con el vector — no solo una masa arbitraria. Esta calculadora convierte una relación molar objetivo inserto:vector en los nanogramos reales de ADN inserto que debes pipetear, considerando cómo la longitud del fragmento afecta la conversión de masa a moles, y muestra las cantidades molares subyacentes de ambas piezas de ADN.
Cómo funciona la Calculadora de Ligación
La ADN ligasa une los extremos compatibles de un vector linearizado y un fragmento de inserto. Como el número de extremos ligables es fijo por molécula independientemente de la longitud, la eficiencia de la ligación depende de la relación molar entre moléculas de inserto y de vector — no de su relación de masas. Esta calculadora parte de la masa y longitud de tu vector, calcula la cantidad molar del vector y luego determina cuánta masa de inserto se necesita para alcanzar tu relación molar objetivo, usando la relación de longitudes inserto:vector como factor de escala.
Las cantidades molares se derivan de la masa de ADN usando la masa promedio estándar de 660 g/mol por par de bases para ADN de doble cadena, la misma constante usada en las demás calculadoras de cantidad de ADN de Calculover (por ejemplo, Número de Copias de ADN) para mantener los resultados consistentes.
Entradas y qué significan
La masa del vector (ng) y la longitud del vector (pb) describen el esqueleto linearizado que mediste por NanoDrop o cuantificación en gel tras la digestión por enzimas de restricción o la linearización por PCR. La longitud del inserto (pb) es el tamaño del fragmento que se está clonando. La relación molar inserto:vector es el exceso objetivo de moléculas de inserto sobre moléculas de vector — 3:1 es un punto de partida típico para ligaciones de extremos cohesivos (por enzima de restricción), mientras que las ligaciones de extremos romos suelen usar relaciones más altas (de 5:1 a 10:1) para compensar la menor eficiencia.
La longitud del inserto tiene el mayor efecto sobre la masa requerida: duplicar la longitud del inserto aproximadamente duplica los ng de inserto necesarios a la misma relación molar, ya que se requiere más masa para alcanzar el mismo número de moléculas.
Límites y casos extremos
Esta calculadora asume ADN de doble cadena estándar y la masa promedio de 660 g/mol/pb ampliamente utilizada — no considera la variación del contenido GC, que desplaza ligeramente el peso molecular real. Las ligaciones de extremos romos generalmente necesitan una relación molar más alta que las de extremos cohesivos para lograr la misma eficiencia, porque carecen de extremos complementarios; ajusta la entrada de la relación en consecuencia en lugar de confiar en un único valor predeterminado. Para ensamblajes multifragmento (Golden Gate o Gibson) con más de un inserto, ejecuta esta calculadora una vez por fragmento contra la misma cantidad de vector.