Calcule la cantidad de ADN de inserción necesaria para una reacción de ligadura de clonación a partir de la cantidad de vector y la relación molar de inserción:vector deseada.
Vector e inserto
Cantidad de digested/linearized vector DNA utilizado en el reaction, en nanograms.
Longitud de el linearized vector, en base pairs.
Longitud de el DNA fragment un ser inserted, en base pairs.
Desired molar excess de insert durante vector — 3:1 es un común inicial point para sticky-end ligations.
Ejemplos de reacciones
Insert DNA Necesario
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Ingrese la masa del vector, la longitud del vector/inserto y la relación molar arriba para calcular cuánto ADN de inserción agregar.
Cantidades molares
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Vector e inserte cantidades molares (pmol), ajustadas en longitud a partir de la masa que ingresó.
Resumen de reacción
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Un resumen de las cantidades de vector e inserto que se combinarán en la reacción de ligadura.
4 min de lectura3 pasos7 términos3 ejemplos6 preguntas frecuentesinsert ng = vector ng × (insert length bp / vector length bp)…
Lograr que una ligación de clonación funcione de forma confiable comienza por agregar la cantidad molar correcta de inserto en relación con el vector — no solo una masa arbitraria.
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Paso a paso
Cómo usar esta calculadora
3 pasos▸
1
Ingresa la masa y longitud del vector
Ingresa la masa del ADN vector linearizado que estás usando (en ng) y su longitud (en pares de bases). Estos datos provienen de tu digestión o linearización por PCR y de una lectura de concentración por NanoDrop o gel.
2
Ingresa la longitud del inserto y la relación molar
Ingresa la longitud del fragmento de inserto (en pb) y tu relación molar objetivo inserto:vector — 3:1 es un punto de partida común para ligaciones de extremos cohesivos. La calculadora se actualiza al instante.
3
Lee la cantidad de inserto necesaria
La pestaña de Cantidad de Inserto muestra cuántos nanogramos de inserto agregar; cambia a Relación Molar para ver las cantidades en pmol, o a Preparación de Reacción para un resumen combinado de ambas cantidades de ADN.
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Referencia
Fórmula y metodología
1 fórmulas▸
Masa de inserto para una relación molar objetivo
insert ng = vector ng × (insert length bp / vector length bp) × molar ratio
Como los fragmentos de ADN de diferente longitud pesan distinto para la misma cantidad molar, la masa de inserto necesaria escala con la relación de longitudes inserto:vector y el exceso molar deseado de inserto sobre vector. Las cantidades molares (pmol) se derivan de la masa usando la masa promedio estándar de 660 g/mol por par de bases para ADN de doble cadena.
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Glosario
Términos clave explicados
7 términos▸
LigaciónLa unión enzimática de dos fragmentos de ADN — típicamente un vector linearizado y un inserto — usando ADN ligasa, que forma los enlaces fosfodiéster que sellan los fragmentos entre sí.
InsertoEl fragmento de ADN que se está clonando en el vector, como un gen o un producto de PCR, medido aquí por su longitud en pares de bases y la masa agregada a la reacción.
VectorEl esqueleto de ADN linearizado (comúnmente un plásmido) en el que se liga el inserto, que aporta el origen de replicación y el marcador seleccionable necesarios para propagar la construcción resultante.
Relación molarLa proporción de moléculas de inserto respecto a moléculas de vector en la reacción de ligación, expresada como inserto:vector (por ejemplo, 3:1). Relaciones más altas aumentan la probabilidad de una ligación exitosa, pero pueden elevar el ruido de fondo por autoligación del inserto.
ClonaciónEl proceso general de insertar un fragmento de ADN en un vector, transformarlo en bacterias y seleccionar las colonias que portan la construcción correcta.
Pares de basesLa unidad usada para medir la longitud del ADN de doble cadena (pb). Tanto la longitud del vector como la del inserto se ingresan en pares de bases, ya que la masa del fragmento escala directamente con la longitud.
TransformaciónEl paso posterior a la ligación en el que el ADN ligado se introduce en células bacterianas competentes, las cuales luego replican la construcción y permiten seleccionarla en placas con antibiótico.
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Escenarios
Ejemplos del mundo real
3 ejemplos▸
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Estudiante de biología molecular
Relación inserto:vector 3:1
Masa del vector (ng) 50Longitud del vector (pb) 3000Longitud del inserto (pb) 1000Relación molar 3
Inserto ng = 50 × (1000/3000) × 3 = 50 ng. Con un vector de un tercio de la longitud del inserto, que cancela el término de relación de longitud contra la relación molar, la masa de inserto necesaria resulta igual a la masa del vector — una útil verificación de sentido común para una ligación estándar de extremos cohesivos 3:1.
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Estudiante de biología molecular
Inserto más largo, misma relación
Masa del vector (ng) 50Longitud del vector (pb) 3000Longitud del inserto (pb) 2500Relación molar 3
Inserto ng = 50 × (2500/3000) × 3 = 125 ng. Manteniendo la misma cantidad de vector y la relación molar 3:1 pero usando un inserto más largo (2500 pb en lugar de 1000 pb), la masa de inserto requerida más que se duplica, ya que se necesita más masa de ADN para alcanzar la misma cantidad molar a mayor longitud.
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Estudiante de biología molecular
Cantidades molares (ligación 5:1)
Masa del vector (ng) 100Longitud del vector (pb) 5000Longitud del inserto (pb) 500Relación molar 5
Vector: 100 ng a 5000 pb ≈ 0.030 pmol. Inserto necesario: 50 ng a 500 pb ≈ 0.152 pmol — exactamente 5 veces la cantidad molar del vector, confirmando la relación molar inserto:vector de 5:1 sin importar las longitudes de fragmento tan diferentes.
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Referencia
Citar esta calculadora
APA y MLA▸
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Lograr que una ligación de clonación funcione de forma confiable comienza por agregar la cantidad molar correcta de inserto en relación con el vector — no solo una masa arbitraria. Esta calculadora convierte una relación molar objetivo inserto:vector en los nanogramos reales de ADN inserto que debes pipetear, considerando cómo la longitud del fragmento afecta la conversión de masa a moles, y muestra las cantidades molares subyacentes de ambas piezas de ADN.
Cómo funciona la Calculadora de Ligación
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La ADN ligasa une los extremos compatibles de un vector linearizado y un fragmento de inserto. Como el número de extremos ligables es fijo por molécula independientemente de la longitud, la eficiencia de la ligación depende de la relación molar entre moléculas de inserto y de vector — no de su relación de masas. Esta calculadora parte de la masa y longitud de tu vector, calcula la cantidad molar del vector y luego determina cuánta masa de inserto se necesita para alcanzar tu relación molar objetivo, usando la relación de longitudes inserto:vector como factor de escala.
Las cantidades molares se derivan de la masa de ADN usando la masa promedio estándar de 660 g/mol por par de bases para ADN de doble cadena, la misma constante usada en las demás calculadoras de cantidad de ADN de Calculover (por ejemplo, Número de Copias de ADN) para mantener los resultados consistentes.
Entradas y qué significan
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La masa del vector (ng) y la longitud del vector (pb) describen el esqueleto linearizado que mediste por NanoDrop o cuantificación en gel tras la digestión por enzimas de restricción o la linearización por PCR. La longitud del inserto (pb) es el tamaño del fragmento que se está clonando. La relación molar inserto:vector es el exceso objetivo de moléculas de inserto sobre moléculas de vector — 3:1 es un punto de partida típico para ligaciones de extremos cohesivos (por enzima de restricción), mientras que las ligaciones de extremos romos suelen usar relaciones más altas (de 5:1 a 10:1) para compensar la menor eficiencia.
La longitud del inserto tiene el mayor efecto sobre la masa requerida: duplicar la longitud del inserto aproximadamente duplica los ng de inserto necesarios a la misma relación molar, ya que se requiere más masa para alcanzar el mismo número de moléculas.
Límites y casos extremos
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Esta calculadora asume ADN de doble cadena estándar y la masa promedio de 660 g/mol/pb ampliamente utilizada — no considera la variación del contenido GC, que desplaza ligeramente el peso molecular real. Las ligaciones de extremos romos generalmente necesitan una relación molar más alta que las de extremos cohesivos para lograr la misma eficiencia, porque carecen de extremos complementarios; ajusta la entrada de la relación en consecuencia en lugar de confiar en un único valor predeterminado. Para ensamblajes multifragmento (Golden Gate o Gibson) con más de un inserto, ejecuta esta calculadora una vez por fragmento contra la misma cantidad de vector.
❓
Preguntas
Preguntas frecuentes
6 preguntas▸
¿Cuál es la fórmula de la calculadora de ligación?+
Inserto ng = vector ng × (longitud del inserto pb / longitud del vector pb) × relación molar. La relación de longitudes inserto:vector escala la masa del vector para tener en cuenta el tamaño del inserto, y la relación molar establece cuántas moléculas de inserto quieres por molécula de vector.
¿Qué relación molar inserto:vector debería usar?+
3:1 es un punto de partida común para ligaciones de extremos cohesivos (extremos compatibles generados por enzimas de restricción). Las ligaciones de extremos romos suelen ser menos eficientes y a menudo usan una relación más alta, como 5:1 a 10:1, para mejorar la probabilidad de una ligación exitosa.
¿Por qué un inserto más largo necesita más ADN en masa?+
La relación molar se trata del número de moléculas, no de su masa. Un fragmento de inserto más largo pesa más por molécula, así que para agregar el mismo número de moléculas de inserto (y alcanzar la relación molar objetivo), necesitas proporcionalmente más nanogramos de ADN inserto.
¿Debería pensar en masa (ng) o en cantidad molar (pmol)?+
La eficiencia de la ligación depende de la relación molar entre moléculas de inserto y de vector, así que la cantidad molar (pmol) es la magnitud que realmente importa biológicamente. La masa (ng) es lo que puedes medir y pipetear, así que esta calculadora convierte entre ambas usando la longitud de cada fragmento.
¿Qué unidades usa la Calculadora de Ligación?+
La masa del vector y la masa del inserto están en nanogramos (ng). Las longitudes del vector y el inserto están en pares de bases (pb). Las cantidades molares se reportan en picomoles (pmol). La relación molar en sí es un número adimensional, como 3 para una relación inserto:vector de 3:1.
¿La relación difiere entre ligaciones de extremos romos y cohesivos?+
Sí. Las ligaciones de extremos cohesivos, que dependen de extremos complementarios generados por digestión con enzimas de restricción, suelen ser eficientes con una relación inserto:vector de 3:1. Las ligaciones de extremos romos carecen de extremos que guíen el apareamiento y son menos eficientes, por lo que los biólogos moleculares suelen usar una relación más alta — a menudo de 5:1 a 10:1 — para compensar.
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