La cuantificación absoluta por qPCR depende de comparar una muestra desconocida contra una curva estándar de conteos moleculares conocidos, no solo de masa conocida. Convertir la masa de un fragmento de ADN en su número real de copias — y luego en una serie de dilución — es el cálculo que conecta una lectura de espectrofotómetro o Qubit con una curva estándar utilizable.

Por qué el número de copias importa más que la masa por sí sola

Dos muestras de ADN con la misma masa pueden contener números muy distintos de moléculas si sus longitudes de fragmento difieren — un fragmento corto de 200 pb tiene muchas más moléculas por nanogramo que un fragmento de 10,000 pb de la misma masa, ya que cada molécula individual pesa menos. Para las curvas estándar de qPCR, lo que importa es el conteo real de moléculas (número de copias), porque los valores de Ct rastrean cuántas copias del blanco están presentes, no cuántos nanogramos. Esta calculadora convierte masa y longitud en número de copias usando el número de Avogadro, la misma constante usada para cualquier conversión de mol a molécula en química.

Por qué ADNbc y ADNmc usan masas promedio distintas

La longitud del ADN de doble cadena se mide en pares de bases, donde cada unidad ya contabiliza ambas cadenas complementarias, así que la aproximación estándar de 660 g/mol por par de bases refleja la masa combinada de ambas cadenas. La longitud del ADN de cadena sencilla se mide por base individual, así que su masa promedio (330 g/mol por base) es aproximadamente la mitad de la de un par de bases — es la masa de solo el nucleótido de una hebra. Usar la configuración de cadena incorrecta para tu tipo de muestra producirá un número de copias que estará desviado por aproximadamente un factor de dos.

Construyendo una serie de dilución seriada para una curva estándar

Una curva estándar de qPCR se construye amplificando varias diluciones de concentración conocida de una plantilla de referencia — a menudo un plásmido linealizado o un producto de PCR — y graficando sus valores de Ct contra log(número de copias). Una dilución seriada 10x a través de 6–8 puntos es la elección convencional, ya que abarca varios órdenes de magnitud manteniendo manejable el número de reacciones. Una vez que conoces la concentración neta en copias/µL, cada estándar subsiguiente es simplemente el anterior diluido por el mismo factor, que es exactamente lo que calcula la pestaña Estándar qPCR.