Calcule el número de moléculas de ADN (número de copias) a partir de la masa y la longitud de un fragmento, luego conviértalo a copias por microlitro y cree una serie de dilución estándar de qPCR.
Fragmento
Ingrese la masa, la longitud y la hebrabilidad de su fragmento de ADN para calcular el número de copias de su molécula.
Strandedness establece la masa promedio por par de bases utilizada en la fórmula.
Base pairs (dsDNA) o bases (ssDNA).
Total masa de DNA en nanograms, e.g. de un spectrophotometer o Qubit reading.
Resultado
—
Ingrese una masa y una longitud arriba para calcular el número de copias.
Volumen de muestra
Utiliza la misma masa, longitud y tipo que la pestaña Número de copia, dividida entre el volumen en el que se disuelve la muestra.
Total volumen el fragment's masa (de el Copy Número tab) es dissolved en.
Resultado
—
Ingrese un volumen arriba para calcular copias por µL.
Serie de diluciones
Crea una serie de diluciones en serie para una curva estándar de qPCR, a partir de la concentración de copias puras/μL en la pestaña Copias por μL.
Fold-dilution applied un each paso (10 es standard para qPCR standard curves).
Número de standard-curve puntos, including el neat (undiluted) stock.
Resultado
—
Introduzca un volumen en la pestaña Copias por µL para crear la serie de dilución.
La cuantificación absoluta por qPCR depende de comparar una muestra desconocida contra una curva estándar de conteos moleculares conocidos, no solo de masa conocida.
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Paso a paso
Cómo usar esta calculadora
4 pasos▸
1
Elige tipo, longitud y masa
En la pestaña Número de Copias, selecciona ADNbc o ADNmc, ingresa la longitud del fragmento en pares de bases (o bases para ADNmc), e ingresa la masa en nanogramos — por ejemplo, de una lectura de Qubit o espectrofotómetro.
2
Lee el número de copias
La tarjeta de resultado se actualiza al instante, mostrando el número total de moléculas de ADN en notación científica, calculado a partir de la masa y la masa promedio por par de bases.
3
Convierte a copias por µL
Cambia a la pestaña Copias por µL e ingresa el volumen en el que está disuelta tu muestra. La calculadora divide el número de copias total del paso 2 entre ese volumen.
4
Construye una serie de dilución para qPCR
En la pestaña Estándar qPCR, establece un factor de dilución (10 es lo estándar) y un número de pasos para generar una tabla de dilución seriada para una curva estándar de cuantificación absoluta por qPCR.
La masa en nanogramos se convierte a gramos, se multiplica por el número de Avogadro (moléculas por mol), y se divide entre el peso molecular total del fragmento (longitud × la masa promedio por par de bases). El ADNbc usa 660 g/mol por par de bases; el ADNmc usa 330 g/mol por base, ya que una hebra sencilla tiene aproximadamente la mitad de la masa de un par de bases.
Copias por microlitro
copies/µL = total copies ÷ volume (µL)
Dividir el número de copias total entre el volumen en el que está disuelta la muestra da la concentración en copias por microlitro — la unidad en la que típicamente se expresan las curvas estándar de qPCR.
Serie de dilución seriada para qPCR
Cₙ = C₁ / factor^(n-1)
Partiendo de la concentración neta (sin diluir) en copias/µL (C₁), cada punto sucesivo de la curva estándar se diluye por el mismo factor de repetición — 10 veces es lo estándar, dando a cada punto un logaritmo menos de concentración que el anterior.
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Glosario
Términos clave explicados
7 términos▸
Número de copiasEl número total de moléculas individuales de ADN presentes en una muestra, calculado a partir de su masa y el peso molecular de una sola molécula usando el número de Avogadro.
ADNbcADN de doble cadena (double-stranded). La longitud se mide en pares de bases (pb); esta calculadora usa una masa promedio de 660 g/mol por par de bases.
Par de bases (pb)Dos nucleótidos complementarios (A-T o G-C) unidos a través de las dos cadenas del ADN de doble cadena — la unidad estándar para medir la longitud de un fragmento de ADNbc.
Número de AvogadroEl número de moléculas en un mol de una sustancia, 6.022 × 10²³. Multiplicar los moles de ADN por esta constante da el conteo total de moléculas.
Masa promedio por pbEl peso molecular medio aportado por un par de bases (o, para ADN de cadena sencilla, una base) — aproximadamente 660 g/mol para ADNbc y 330 g/mol para ADNmc. Esta aproximación independiente de la secuencia es estándar en biología molecular, aunque el valor exacto varía ligeramente con la composición de bases.
qPCRPCR cuantitativa (en tiempo real) — una técnica que mide la amplificación del ADN a medida que ocurre, usada a menudo para determinar el número de copias absoluto de una secuencia blanco en una muestra desconocida comparándola con una curva estándar de diluciones de concentración conocida.
PlásmidoUna molécula de ADN pequeña, circular y de doble cadena, separada del ADN cromosómico, comúnmente usada para portar un gen de interés y a menudo usada para preparar estándares de número de copias para qPCR porque su tamaño y secuencia exactos se conocen.
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Escenarios
Ejemplos del mundo real
3 ejemplos▸
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Cuantificando una preparación de plásmido
100 ng de un fragmento de ADNbc de 1,000 pb
Tipo ADNbcLongitud 1,000 pbMasa 100 ng
copies = (100 × 10⁻⁹ × 6.022 × 10²³) / (1,000 × 660) ≈ 9.12 × 10¹⁰ copias. Este es el conteo total de moléculas en toda la muestra de 100 ng, antes de considerar en qué volumen está disuelta.
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Convirtiendo a una concentración de trabajo
La misma muestra de 100 ng, disuelta en 50 µL
Copias totales ≈ 9.12 × 10¹⁰Volumen 50 µL
copies/µL = 9.12 × 10¹⁰ ÷ 50 ≈ 1.82 × 10⁹ copias/µL. Esta concentración es la que cargarías en una reacción de qPCR, o usarías como el punto neto de una curva estándar.
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Construyendo una curva estándar para qPCR
Serie de dilución 10x, 7 puntos, partiendo de 1.82 × 10⁹ copias/µL
Concentración neta 1.82 × 10⁹ copias/µLFactor de dilución 10Pasos 7
Cada paso divide la concentración anterior entre 10, terminando en ≈ 1.82 × 10³ copias/µL en el punto 7 — un rango de seis logaritmos que es típico para establecer una curva estándar de qPCR confiable.
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Referencia
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APA y MLA▸
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Análisis a fondo
De la Masa a las Moléculas: Número de Copias de ADN y Estándares de qPCR
La cuantificación absoluta por qPCR depende de comparar una muestra desconocida contra una curva estándar de conteos moleculares conocidos, no solo de masa conocida. Convertir la masa de un fragmento de ADN en su número real de copias — y luego en una serie de dilución — es el cálculo que conecta una lectura de espectrofotómetro o Qubit con una curva estándar utilizable.
Por qué el número de copias importa más que la masa por sí sola
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Dos muestras de ADN con la misma masa pueden contener números muy distintos de moléculas si sus longitudes de fragmento difieren — un fragmento corto de 200 pb tiene muchas más moléculas por nanogramo que un fragmento de 10,000 pb de la misma masa, ya que cada molécula individual pesa menos. Para las curvas estándar de qPCR, lo que importa es el conteo real de moléculas (número de copias), porque los valores de Ct rastrean cuántas copias del blanco están presentes, no cuántos nanogramos. Esta calculadora convierte masa y longitud en número de copias usando el número de Avogadro, la misma constante usada para cualquier conversión de mol a molécula en química.
Por qué ADNbc y ADNmc usan masas promedio distintas
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La longitud del ADN de doble cadena se mide en pares de bases, donde cada unidad ya contabiliza ambas cadenas complementarias, así que la aproximación estándar de 660 g/mol por par de bases refleja la masa combinada de ambas cadenas. La longitud del ADN de cadena sencilla se mide por base individual, así que su masa promedio (330 g/mol por base) es aproximadamente la mitad de la de un par de bases — es la masa de solo el nucleótido de una hebra. Usar la configuración de cadena incorrecta para tu tipo de muestra producirá un número de copias que estará desviado por aproximadamente un factor de dos.
Construyendo una serie de dilución seriada para una curva estándar
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Una curva estándar de qPCR se construye amplificando varias diluciones de concentración conocida de una plantilla de referencia — a menudo un plásmido linealizado o un producto de PCR — y graficando sus valores de Ct contra log(número de copias). Una dilución seriada 10x a través de 6–8 puntos es la elección convencional, ya que abarca varios órdenes de magnitud manteniendo manejable el número de reacciones. Una vez que conoces la concentración neta en copias/µL, cada estándar subsiguiente es simplemente el anterior diluido por el mismo factor, que es exactamente lo que calcula la pestaña Estándar qPCR.
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Preguntas
Preguntas frecuentes
6 preguntas▸
¿Qué fórmula usa la Calculadora de Número de Copias de ADN?+
copies = (masa en ng × 10⁻⁹ × número de Avogadro) / (longitud × masa promedio por pb o base). El número de Avogadro es 6.022 × 10²³ moléculas por mol. El ADNbc usa 660 g/mol por par de bases; el ADNmc usa 330 g/mol por base.
¿Qué masa promedio por par de bases usa esta calculadora, y por qué?+
660 g/mol por par de bases para ADNbc y 330 g/mol por base para ADNmc. Estas son aproximaciones estándar independientes de la secuencia usadas en toda la biología molecular; el valor exacto para una secuencia real varía ligeramente (aproximadamente 650–660 g/mol/pb) dependiendo de su composición precisa de A/T/G/C.
¿Por qué necesitaría una curva estándar de qPCR?+
La qPCR en tiempo real mide ciclos de amplificación (valores de Ct), no conteos de moléculas directamente. Para determinar el número absoluto de copias del blanco en una muestra desconocida, comparas su valor de Ct contra una curva estándar construida a partir de diluciones seriadas de una plantilla de referencia con números de copias conocidos — que es exactamente lo que la pestaña Estándar qPCR te ayuda a construir.
¿Qué unidades usa el resultado?+
La pestaña Número de Copias reporta el número total de moléculas de ADN (un conteo simple, mostrado en notación científica ya que los números son muy grandes). La pestaña Copias por µL reporta ese mismo conteo dividido entre el volumen de tu muestra, en copias por microlitro — la unidad estándar para las concentraciones de curvas estándar de qPCR.
¿En qué se diferencia el ADNmc del ADNbc en esta calculadora?+
Selecciona ADNmc si tu muestra es de cadena sencilla (p. ej. un oligo sintético o el genoma de un virus de ADNmc) e ingresa su longitud en bases en lugar de pares de bases. La calculadora entonces usa 330 g/mol por base en lugar de 660 g/mol por par de bases, ya que una hebra sencilla lleva aproximadamente la mitad de la masa de un par de bases.
¿Cómo convierto mi número de copias total en copias por µL?+
Ingresa el volumen en el que está disuelto tu ADN (en microlitros) en la pestaña Copias por µL. La calculadora divide el número de copias total de la pestaña Número de Copias entre ese volumen para dar la concentración en copias/µL, que luego puedes llevar a la pestaña Estándar qPCR.
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