Estimar cuánto ADN o ARN hay en una muestra es una de las primeras verificaciones en casi todo flujo de trabajo de biología molecular — antes de clonar, secuenciar, hacer PCR o transfectar. Los espectrofotómetros modernos y los instrumentos NanoDrop hacen esto rápido, pero interpretar los números correctamente sigue dependiendo de entender qué significan realmente el A260, el factor de conversión y la relación de pureza 260/280.
Por qué el A260 mide la concentración de ácido nucleico
El ADN y el ARN absorben luz ultravioleta con mayor intensidad alrededor de 260 nanómetros, en gran parte debido a los anillos aromáticos de sus bases nucleotídicas. Según la ley de Beer-Lambert, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración para una longitud de trayecto fija, así que una lectura de espectrofotómetro a 260 nm (A260) puede convertirse en una concentración una vez que conoces la constante de proporcionalidad correcta para el tipo de ácido nucleico que estás midiendo.
Por qué el factor difiere según el tipo de ácido nucleico
El factor de conversión — 50 µg/mL por unidad de A260 para ADN de doble cadena, 33 µg/mL para ADN de cadena sencilla, y 40 µg/mL para ARN — difiere porque estas moléculas absorben la luz de 260 nm de manera ligeramente distinta por unidad de masa. El apilamiento de bases de la doble hélice en el ADNbc reduce algo su absorbancia comparada con hebras sencillas no estructuradas, razón por la cual el ADNmc y el ARN (ambos típicamente menos apareados en solución) tienen factores por masa más bajos. Usar el factor incorrecto para tu tipo de muestra es una de las fuentes más comunes de una estimación de concentración inexacta.
Leyendo la relación de pureza 260/280
Las proteínas absorben luz UV con mayor intensidad alrededor de 280 nm debido a aminoácidos aromáticos como el triptófano y la tirosina, mientras que los ácidos nucleicos absorben con mayor intensidad a 260 nm. Comparar ambas absorbancias (A260/A280) da entonces una estimación rápida de cuánta contaminación proteica queda en una muestra extraída. Una relación cercana a 1.8 se considera ADN de doble cadena puro; una relación cercana a 2.0 se considera ARN puro. Relaciones notablemente por debajo de estos valores suelen apuntar a proteína o fenol residual del proceso de extracción, mientras que relaciones notablemente por encima pueden indicar contaminación de ARN en una preparación de ADN o una muestra degradada.
Por qué la dilución importa para lecturas precisas
Las lecturas de absorbancia del espectrofotómetro solo son confiablemente lineales con la concentración hasta aproximadamente un A260 de 1.0–2.0, dependiendo del instrumento. Las muestras más concentradas que eso deben diluirse antes de leerse, y luego la concentración calculada de la lectura diluida se multiplica por el factor de dilución para recuperar la concentración de la solución madre original — que es exactamente lo que automatiza la pestaña Dilución de esta calculadora.
Limitaciones de las estimaciones basadas en A260
Las estimaciones basadas en A260/A280 son rápidas y convenientes, pero son menos precisas que los métodos de cuantificación basados en fluorescencia (como los ensayos PicoGreen o Qubit), que se unen específicamente al ADN de doble cadena y son mucho menos sensibles a ARN contaminante, nucleótidos libres o proteína. Para aplicaciones con requisitos de cuantificación estrictos — como la preparación de bibliotecas para secuenciación de nueva generación — los laboratorios a menudo confirman una estimación basada en NanoDrop con un ensayo basado en fluorescencia antes de continuar.