Calculadora de concentração de proteínas

Calcule a concentração de proteína a partir de uma leitura de absorbância A280 e do coeficiente de extinção (Beer-Lambert) ou de um método de curva padrão.

Converta uma leitura de absorbância UV-Vis A280 em uma concentração de proteína usando a lei de Beer-Lambert: C = A280 / (ε × l). Escolha um coeficiente de extinção molar (precisa de peso molecular) ou baseado em massa (não).

Lendo A280

Absorvância a 280 nm (sem unidade).

Unidades de coeficiente de extinção

Coeficiente de extinção (ε)

por exemplo BSA ε280 ≈ 43.824 M⁻¹cm⁻¹.

Peso molecular (Da)

por exemplo BSA ≈ 66.500 Da. Necessário para ε molar.

Comprimento do caminho (cm)

O comprimento padrão do caminho da cubeta é de 1 cm.

Fator de diluição

1 se estiver lendo a amostra não diluída.

Resultado

—

Insira valores para calcular.

Concentração—

Molar (μM)—

Como lido (sem escala)—

6 min de leitura 3 etapas 7 termos 3 exemplos 6 perguntas C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × l)] × MW

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Etapas

Como usar esta calculadora

3 etapas

Escolha um modo e insira sua leitura

Na guia Do A280, insira a leitura de absorbância A280 do seu espectrofotômetro, escolha se o seu coeficiente de extinção é molar (M⁻¹cm⁻¹, precisa de um peso molecular) ou baseado em massa ((mg/mL)⁻¹cm⁻¹, sem necessidade de peso molecular) e insira o valor do coeficiente e o comprimento do caminho da cubeta (1 cm para a maioria dos instrumentos). Se você estiver trabalhando a partir de uma curva padrão de Bradford ou BCA, mude para a guia Curva padrão e insira a inclinação e a interceptação da curva junto com a absorbância da sua amostra.

Leia a concentração em mg/mL e μM

O cartão de resultados mostra a concentração de proteína em mg/mL juntamente com uma interpretação em linguagem simples. Sempre que um peso molecular estiver disponível (sempre no modo molar, opcionalmente no modo de massa se você também inserir um), a concentração molar em µM também será mostrada – útil para estequiometria ou cálculos de ligação.

Use a guia Diluição para amostras diluídas

Se a sua amostra estiver muito concentrada para ser lida diretamente, dilua-a, leia o A280 diluído e, em seguida, use a guia Diluição para dimensionar essa leitura de volta à concentração do estoque original. Ele relata tanto o valor lido (o que está literalmente na cubeta) quanto a concentração de estoque ampliada. Tudo é atualizado instantaneamente – não há botão de cálculo.

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Referência

Fórmula e metodologia

4 fórmulas

Concentração de A280 (coeficiente de extinção molar)

C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × l)] × MW

A lei de Beer-Lambert afirma que a absorbância é proporcional à concentração e ao comprimento do caminho: A = ε × l × c. A resolução da concentração molar dá c (mol/L) = A280 / (ε_M × l), onde ε_M é o coeficiente de extinção molar em M⁻¹cm⁻¹ e l é o comprimento do caminho em cm (1 cm para uma cubeta padrão). Multiplicar a concentração molar pelo peso molecular da proteína (PM, em g/mol ou Da) converte mol/L em g/L, que é numericamente idêntico a mg/mL — nenhuma conversão adicional de unidade é necessária.

Concentração de A280 (coeficiente de extinção em massa)

C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × l)

Alguns coeficientes de extinção publicados – frequentemente rotulados como ε(0,1%) ou E1%₂₈₀ – já são expressos em massa, em unidades de (mg/mL)⁻¹cm⁻¹. Nesse caso, a concentração de massa cai diretamente de Beer-Lambert sem a necessidade de peso molecular: C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × l). Um peso molecular ainda pode ser fornecido posteriormente para relatar adicionalmente uma concentração molar (µM).

Curva padrão

C = (A - interceptação) / inclinação

Uma curva padrão (normalmente construída com um ensaio de Bradford ou BCA e concentrações conhecidas de BSA) ajusta-se a uma linha reta, absorbância = inclinação × concentração + interceptação, a um conjunto de padrões de concentração conhecida. Uma vez ajustada, a concentração de uma amostra desconhecida é lida na linha resolvendo a concentração dada a sua absorbância medida.

Escala de diluição

C_stock = C_as-read × dilution factor

Quando uma amostra é diluída antes da leitura – necessária quando a absorbância sobe acima de aproximadamente 1,0–1,5, onde a linearidade do espectrofotômetro é quebrada – a concentração calculada a partir da leitura diluída descreve apenas a amostra diluída. Multiplicar pelo fator de diluição (por exemplo, 10 para uma diluição de 1:10) recupera a concentração do estoque original não diluído.

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Glossário

Principais termos explicados

7 termos

Concentração de proteína A quantidade de proteína dissolvida em um determinado volume de solução, mais comumente expressa em mg/mL (concentração de massa) ou µM/mol por litro (concentração molar).

A280 A absorbância de uma amostra em um comprimento de onda de 280 nanômetros, o ponto onde os aminoácidos aromáticos triptofano, tirosina e (fracamente) fenilalanina absorvem a luz UV. É a medição padrão, rápida e não destrutiva usada para estimar a concentração de proteínas.

Coeficiente de extinção Uma constante de proporcionalidade (ε) que descreve a intensidade com que uma substância absorve luz em um determinado comprimento de onda. Para proteínas, pode ser expresso em base molar (M⁻¹cm⁻¹, requer um peso molecular para obter uma concentração de massa) ou em base de massa ((mg/mL)⁻¹cm⁻¹, produz a concentração de massa diretamente).

Lei Beer-Lambert A lei física que estabelece a absorbância é diretamente proporcional à concentração e ao comprimento do caminho: A = ε × l × c. Está subjacente a todas as estimativas de concentração espectrofotométrica, incluindo a quantificação de proteínas baseada em A280.

Concentração molar vs. concentração de massa A concentração molar (mol/L ou µM em níveis baixos) conta moléculas de proteína independentemente do tamanho; concentração de massa (mg/mL) pesa a massa total de proteína. A conversão entre eles requer o peso molecular da proteína: massa = molar × PM.

Curva padrão Uma linha de calibração construída medindo a absorbância de várias amostras de concentração de proteína conhecida (geralmente BSA) e, em seguida, ajustando uma linha (absorbância versus concentração) usada para ler a concentração de amostras desconhecidas a partir de sua absorbância medida.

NanoDrop Uma marca comum de espectrofotômetro de microvolume usado em laboratórios de biologia molecular e bioquímica para medir A280 e concentração de proteína derivada de apenas 1–2 µL de amostra sem uma cubeta tradicional.

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Situações comuns

Exemplos práticos

3 exemplos

🧫

Quantificando uma preparação de lisozima purificada

A280 com coeficiente de extinção molar

Leitura A280 0.5 Coeficiente de extinção (molar) 36.000 M⁻¹cm⁻¹ Peso molecular 14300 Da

C = [0,5 / (36.000 × 1)] × 14.300 ≈ 0,199 mg/mL (≈13,9 µM). O coeficiente de extinção bem caracterizado da lisozima torna o A280 uma maneira rápida e confiável de verificar o rendimento após a purificação.

🧪

Lendo uma incógnita em relação a uma curva padrão BSA

Curva padrão (ensaio Bradford/BCA)

Inclinação 1.2 Interceptar 0.05 Absorvância (desconhecida) 0.65

C = (0,65 − 0,05) / 1,2 = 0,5 mg/mL. Os ensaios de Bradford e BCA não dependem do conteúdo de triptofano/tirosina, portanto, uma curva padrão é frequentemente preferida para proteínas com composição incomum de aminoácidos.

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Lendo uma preparação concentrada de anticorpos após diluição

Dimensionando uma leitura A280 diluída

Leitura A280 (diluída) 0.4 Coeficiente de extinção (molar) 43824 M⁻¹cm⁻¹ Peso molecular 66.500 Da Fator de diluição 10

A própria amostra diluída apresenta leitura de ≈0,607 mg/mL; uma diluição de 1:10 foi lida para permanecer dentro da faixa linear do instrumento, portanto, a escala pelo fator de diluição mostra que o estoque não diluído é ≈6,07 mg/mL.

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Referência

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Análise detalhada

Como calcular a concentração de proteínas a partir de uma leitura do A280

5 capítulos · 6 min de leitura

Saber exatamente quanta proteína existe em uma amostra – antes de executar um gel, preparar um ensaio enzimático ou normalizar um Western blot – é uma das medições mais rotineiras em um laboratório de bioquímica ou biologia molecular. A espectrofotometria UV a 280 nm torna isso rápido e não destrutivo, mas obter um número preciso depende da escolha do coeficiente de extinção correto e da compreensão do que a lei de Beer-Lambert está realmente medindo.

Por que o A280 mede a concentração de proteínas

As proteínas absorvem mais fortemente a luz ultravioleta em torno de 280 nanômetros por causa das cadeias laterais aromáticas do triptofano e da tirosina (e, mais fracamente, da fenilalanina e das ligações dissulfeto). De acordo com a lei de Beer-Lambert, a absorbância é diretamente proporcional à concentração para um comprimento de caminho fixo, portanto, medir A280 permite calcular retroativamente a concentração depois de conhecer o coeficiente de extinção da amostra - a constante de proporcionalidade que liga a absorbância à quantidade de proteína realmente presente.

Coeficientes molares vs. extinção em massa

Os coeficientes de extinção para proteínas são publicados em duas convenções diferentes. Um coeficiente de extinção molar (ε_M, em M⁻¹cm⁻¹) descreve a absorbância por mol de proteína e requer o peso molecular da proteína para converter o resultado em uma concentração de massa (mg/mL). Um coeficiente de extinção em massa (frequentemente rotulado como ε (0,1%) ou E1%₂₈₀, em (mg/mL)⁻¹cm⁻¹) descreve a absorbância por unidade de concentração de massa diretamente, ignorando totalmente a etapa de peso molecular. Misturar as duas convenções – inserir um valor molar em uma fórmula baseada em massa ou vice-versa – é uma das fontes mais comuns de erro de ordem de grandeza na quantificação de proteínas.

Por que um coeficiente de extinção teórico pode estar errado

Os coeficientes de extinção molar são geralmente calculados teoricamente a partir da sequência de aminoácidos de uma proteína - contando os resíduos de triptofano, tirosina e cistina (cisteína ligada por dissulfeto) e somando suas contribuições conhecidas por resíduo. Isso funciona bem para a maioria das proteínas solúveis e bem dobradas, mas pode subestimar ou superestimar a absorbância para proteínas com dobramento incomum, cofatores ligados ou poucos resíduos aromáticos. Etiquetas de fusão, desnaturantes e pH também podem desviar o verdadeiro coeficiente de extinção do valor teórico.

Quando usar uma curva padrão

Ensaios colorimétricos como Bradford (ligação de corante Coomassie) e BCA (ácido bicinconínico, redução de cobre) não dependem da própria absorção de UV de uma proteína — eles medem uma mudança de cor proporcional à massa total de proteína, calibrada contra uma curva padrão construída a partir de concentrações conhecidas de uma proteína de referência, geralmente albumina sérica bovina (BSA). Esses métodos são menos sensíveis à composição de aminoácidos de uma proteína específica do que o A280, o que os torna uma boa verificação cruzada — ou o método primário — para proteínas com poucos resíduos de triptofano/tirosina, ou para lisados brutos contendo muitas proteínas diferentes ao mesmo tempo.

Limitações das estimativas baseadas no A280

As leituras do A280 são rápidas, mas assumem que a amostra está livre de outros contaminantes que absorvem UV – os ácidos nucleicos, em particular, absorvem fortemente a 260 nm e podem sangrar na leitura de 280 nm, aumentando a concentração aparente de proteína. Amostras turvas ou particuladas dispersam a luz e também aumentam a leitura. Para uma quantificação mais rigorosa, compare uma estimativa baseada em A280 com um ensaio colorimétrico (Bradford/BCA) ou, onde a precisão absoluta é mais importante, uma análise de aminoácidos.

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Perguntas

Perguntas frequentes

6 perguntas

Qual é a fórmula para concentração de proteína do A280?+

Usando um coeficiente de extinção molar: C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × comprimento do caminho)] × peso molecular. Usando um coeficiente de extinção baseado em massa (sem necessidade de peso molecular): C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × comprimento do caminho). Ambos vêm da lei de Beer-Lambert, A = ε × l × c.

Por que o A280 mede a concentração de proteínas?+

Os aminoácidos aromáticos triptofano e tirosina (e, mais fracamente, ligações fenilalanina e cistina/dissulfeto) absorvem mais fortemente a luz ultravioleta em torno de 280 nanômetros. Como a absorbância é proporcional à concentração de acordo com a lei de Beer-Lambert, a medição de A280 permite estimar a quantidade de proteína presente.

Qual é a diferença entre um coeficiente de extinção molar e um coeficiente de extinção em massa?+

Um coeficiente de extinção molar (M⁻¹cm⁻¹) é a absorbância por mol de proteína e precisa do peso molecular para ser convertido em uma concentração de massa. Um coeficiente de extinção em massa ((mg/mL)⁻¹cm⁻¹, às vezes publicado como ε(0,1%) ou E1%₂₈₀) é a absorbância por unidade de concentração de massa e fornece mg/mL diretamente, sem necessidade de peso molecular.

O que é uma curva padrão e quando devo usá-la?+

Uma curva padrão é uma linha de calibração construída a partir da absorvância medida de várias amostras com concentração de proteína conhecida (normalmente BSA num ensaio de Bradford ou BCA). É útil quando você não conhece o coeficiente de extinção da sua proteína ou quando trabalha com uma mistura de proteínas (como um lisado celular bruto) onde um único coeficiente de extinção não se aplica.

Quais unidades esta calculadora usa?+

A280 e a absorbância da curva padrão não têm unidade. A concentração de massa é relatada em mg/mL. A concentração molar, mostrada sempre que um peso molecular está disponível, é relatada em µM (micromolar). O peso molecular é inserido em Daltons (Da), numericamente igual a g/mol.

Como faço para usar o fator de diluição?+

Se a absorbância da sua amostra for muito alta para ser lida com precisão (normalmente acima de um A280 de aproximadamente 1,0–1,5), dilua-a antes da leitura e insira o fator de diluição - por exemplo, 10 para uma diluição de 1:10 — na guia De A280 ou Diluição. A calculadora multiplica a concentração da leitura diluída pelo fator de diluição para relatar a concentração original e não diluída do estoque.

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