A temperatura de fusão (Tm) de um primer de PCR é um dos primeiros números que um biólogo molecular verifica ao projetar ou solucionar problemas de uma reação – ela determina a temperatura de recozimento, e uma Tm mal estimada é um motivo comum pelo qual as reações de PCR não conseguem amplificar ou amplificam o produto errado. Esta calculadora implementa os dois métodos de estimativa de livros didáticos, informa qual deles se ajusta ao comprimento do seu primer e converte o resultado em uma temperatura inicial de recozimento.
Como funciona a Calculadora Primer Tm
A calculadora conta as bases A, T, G e C na sequência colada e aplica uma das duas fórmulas clássicas. A regra de Wallace (Tm = 2(A+T) + 4(G+C)) é uma contagem ponderada simples que funciona bem para oligonucleotídeos curtos, aproximadamente 14 nucleotídeos ou menos. O método GC% (Tm = 64,9 + 41·(GC − 16,4)/N) é dimensionado com o conteúdo de GC em relação ao comprimento total do primer e é a fórmula mais comumente recomendada para os primers de 15-30 nucleotídeos usados em PCR típica. A calculadora seleciona automaticamente qualquer método adequado ao comprimento da sua sequência, embora você sempre possa substituí-lo - a guia Comparação de métodos mostra os dois valores lado a lado para que você possa ver a distância entre eles para seu primer específico.
Escolhendo um método e lendo a temperatura de recozimento
Se você não tiver certeza em qual método confiar, a recomendação baseada em comprimento é um padrão razoável: use Wallace para primers muito curtos e GC% para primers PCR de comprimento padrão. A temperatura de recozimento sugerida (Tm - 5°C) é um ponto de partida amplamente utilizado, não uma garantia. Na prática, os laboratórios geralmente executam um gradiente de PCR em alguns graus em torno dessa estimativa para encontrar a temperatura que fornece a amplificação mais limpa e específica para seu par de primers, modelo e polimerase específicos.
Limites e casos extremos
Ambas as fórmulas aqui são estimativas de composição de sequência e não levam em conta a concentração de sal/íon, a concentração de primer ou as energias específicas de empilhamento entre bases vizinhas - todas as quais mudam a Tm real. Laboratórios que precisam de maior precisão normalmente usam um modelo termodinâmico do vizinho mais próximo, que leva em conta o contexto de sequência de cada par de bases, em vez de apenas as contagens gerais de A/T/G/C; esse método não está implementado aqui. Caracteres não-ACGT (códigos de ambiguidade, espaços em branco, texto perdido de um arquivo colado) são removidos e contados separadamente, em vez de serem contados incorretamente. Verifique a guia Primer Stats se o resultado parecer errado, já que uma contagem inesperada de caracteres geralmente significa que algo não foi colado corretamente.