Calcule a quantidade de inserção de DNA necessária para uma reação de ligação de clonagem a partir da quantidade de vetor e da proporção molar inserção:vetor desejada.
Vetor e Inserção
Quantidade de DNA vetorial digerido/linearizado utilizado na reação, em nanogramas.
Comprimento do vetor linearizado, em pares de bases.
Comprimento do fragmento de DNA a ser inserido, em pares de bases.
Inserção de excesso molar desejado durante o vetor — 3:1 é um ponto inicial comum para ligaduras de extremidade adesiva.
Exemplos de reações
Inserir DNA obrigatório
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Insira a massa do vetor, comprimento do vetor/inserção e razão molar acima para calcular quanto inserir DNA adicionar.
Quantidades molares
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Vector e insira quantidades molares (pmol), ajustadas em comprimento a partir da massa inserida.
Resumo da reação
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Um resumo das quantidades de vetor e inserção a serem combinadas na reação de ligação.
4 min de leitura3 etapas7 termos3 exemplos6 perguntasinsert ng = vector ng × (insert length bp / vector length bp)…
Fazer com que uma ligadura de clonagem funcione de forma confiável começa com a adição da quantidade molar correta de inserção em relação ao vetor - não apenas uma massa arbitrária.
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Etapas
Como usar esta calculadora
3 etapas▸
1
Insira a massa e o comprimento do vetor
Insira a massa do DNA vetorial linearizado que você está usando (em ng) e seu comprimento (em pares de bases). Eles vêm de sua linearização de digestão ou PCR e de uma leitura de concentração NanoDrop ou à base de gel.
2
Insira o comprimento da pastilha e a relação molar
Insira o comprimento do fragmento de inserção (em bp) e sua proporção molar de inserção:vetor alvo - 3:1 é um ponto de partida comum para ligaduras de extremidade adesiva. A calculadora é atualizada instantaneamente.
3
Leia a quantidade de inserção necessária
A guia Valor da Inserção mostra quantos nanogramas de inserção devem ser adicionados; mude para Razão Molar para ver as quantidades de pmol ou Configuração de reação para um resumo combinado de ambas as quantidades de DNA.
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Referência
Fórmula e metodologia
1 fórmulas▸
Insira a massa para uma razão molar alvo
insert ng = vector ng × (insert length bp / vector length bp) × molar ratio
Como os fragmentos de DNA de diferentes comprimentos pesam diferentemente na mesma quantidade molar, a massa da inserção necessária é dimensionada com a proporção da inserção:comprimento do vetor e o excesso molar desejado da inserção sobre o vetor. As quantidades molares (pmol) são derivadas da massa usando a massa média padrão de 660 g/mol por par de bases para DNA de fita dupla.
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Glossário
Principais termos explicados
7 termos▸
LigaduraA união enzimática de dois fragmentos de DNA – normalmente um vetor linearizado e uma inserção – usando DNA ligase, que forma as ligações fosfodiéster que selam os fragmentos.
InserirO fragmento de DNA sendo clonado no vetor, como um gene ou produto de PCR, medido aqui pelo seu comprimento em pares de bases e pela massa adicionada à reação.
VetorA estrutura de DNA linearizada (geralmente um plasmídeo) à qual a inserção é ligada, fornecendo a origem de replicação e o marcador selecionável necessário para propagar a construção resultante.
Razão molarA proporção de moléculas de inserção para moléculas de vetor na reação de ligação, expressa como inserção:vetor (por exemplo, 3:1). Razões mais altas aumentam a chance de uma ligadura bem-sucedida, mas podem aumentar o histórico da autoligadura do inserto.
ClonagemO processo geral de inserção de um fragmento de DNA em um vetor, transformando-o em bactérias e selecionando colônias que carregam a construção correta.
Pares de basesA unidade usada para medir o comprimento do DNA de fita dupla (pb). Os comprimentos do vetor e da inserção são inseridos em pares de bases, uma vez que a massa do fragmento é dimensionada diretamente com o comprimento.
TransformaçãoA etapa após a ligação onde o DNA ligado é introduzido em células bacterianas competentes, que então replicam a construção e permitem que ela seja selecionada em placas de antibióticos.
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Situações comuns
Exemplos práticos
3 exemplos▸
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Estudante de biologia molecular
Relação inserção:vetor de 3:1
Massa vetorial (ng) 50Comprimento do vetor (bp) 3000Comprimento da inserção (bp) 1000Razão molar 3
Inserir ng = 50 × (1000/3000) × 3 = 50 ng. Com um vetor com um terço do comprimento do inserto cancelando o termo da razão de comprimento em relação à razão molar, a massa do inserto necessária é igual à massa do vetor - uma verificação de sanidade útil para uma ligadura de extremidade adesiva padrão 3:1.
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Estudante de biologia molecular
Inserto mais longo, mesma proporção
Massa vetorial (ng) 50Comprimento do vetor (bp) 3000Comprimento da inserção (bp) 2500Razão molar 3
Inserir ng = 50 × (2500/3000) × 3 = 125 ng. Manter a mesma quantidade de vetor e proporção molar de 3:1, mas usando uma inserção mais longa (2.500 pb em vez de 1.000 pb) mais que dobra a massa necessária da inserção, uma vez que é necessária mais massa de DNA para atingir a mesma quantidade molar em maior comprimento.
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Estudante de biologia molecular
Quantidades molares (ligação 5:1)
Massa vetorial (ng) 100Comprimento do vetor (bp) 5000Comprimento da inserção (bp) 500Razão molar 5
Vetor: 100 ng a 5.000 pb ≈ 0,030 pmol. Inserção necessária: 50 ng a 500 pb ≈ 0,152 pmol - exatamente 5 vezes a quantidade molar do vetor, confirmando a proporção molar inserção:vetor de 5:1, independentemente dos comprimentos de fragmento muito diferentes.
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Referência
Citar esta calculadora
APA e MLA▸
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Fazer com que uma ligadura de clonagem funcione de forma confiável começa com a adição da quantidade molar correta de inserção em relação ao vetor - não apenas uma massa arbitrária. Esta calculadora converte uma proporção molar de inserção:vetor alvo em nanogramas reais de DNA de inserção para pipeta, contabilizando como o comprimento do fragmento afeta a conversão de massa em mole e mostra as quantidades molares subjacentes para ambos os pedaços de DNA.
Como funciona a Calculadora de Ligadura
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A DNA ligase une extremidades compatíveis de um vetor linearizado e um fragmento de inserção. Como o número de extremidades ligáveis é fixado por molécula, independentemente do comprimento, a eficiência da ligação depende da razão molar entre o inserto e as moléculas do vetor - e não da sua razão de massa. Esta calculadora começa com a massa e o comprimento do vetor, calcula a quantidade molar do vetor e, em seguida, calcula quanta massa de inserção é necessária para atingir a proporção molar desejada usando a proporção inserção:comprimento do vetor como um fator de escala.
As quantidades molares são derivadas da massa de DNA usando a massa média padrão de 660 g/mol por par de bases para DNA de fita dupla, a mesma constante usada em outras calculadoras de quantidade de DNA do Calculover (por exemplo, DNA Copy Número) para que os resultados permaneçam consistentes.
Entradas e o que elas significam
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A massa do vetor (ng) e o comprimento do vetor (pb) descrevem a estrutura linearizada que você mediu pelo NanoDrop ou quantificação em gel após digestão de restrição ou linearização por PCR. O comprimento da inserção (bp) é o tamanho do fragmento que está sendo clonado. A proporção molar inserção:vetor é o excesso alvo de moléculas de inserção sobre moléculas de vetor - 3:1 é um ponto de partida típico para ligaduras de extremidade pegajosa (enzima de restrição), enquanto ligaduras de extremidade romba geralmente usam proporções mais altas (5:1 a 10:1) para compensar a menor eficiência.
O comprimento da inserção tem o maior efeito na massa necessária: dobrando o comprimento da inserção aproximadamente dobra o ng de inserto necessário na mesma proporção molar, uma vez que é necessária mais massa para atingir o mesmo número de moléculas.
Limites e casos extremos
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Esta calculadora assume o DNA de fita dupla padrão e a massa média amplamente utilizada de 660 g/mol/pb — ela não leva em conta a variação do conteúdo de GC, que altera ligeiramente o peso molecular verdadeiro. As ligaduras de extremidade romba normalmente precisam de uma proporção molar mais alta do que as ligaduras de extremidade adesiva para atingir a mesma eficiência porque não possuem saliências complementares; ajuste a entrada da proporção de acordo, em vez de confiar em um único padrão. Para montagens de vários fragmentos (Golden Gate ou Gibson) com mais de uma inserção, execute esta calculadora uma vez por fragmento em relação à mesma quantidade de vetor.
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Perguntas
Perguntas frequentes
6 perguntas▸
Qual é a fórmula da calculadora de ligadura?+
Inserir ng = vetor ng × (inserir comprimento bp / comprimento do vetor bp) × razão molar. A proporção inserção:comprimento do vetor dimensiona a massa do vetor para levar em conta o tamanho da inserção, e a proporção molar define quantas moléculas de inserção você deseja por molécula de vetor.
Qual proporção molar inserção:vetor devo usar?+
3:1 é um ponto de partida comum para ligaduras de extremidade adesiva (saliências compatíveis com enzimas de restrição). As ligaduras de extremidade romba são geralmente menos eficientes e muitas vezes usam uma proporção mais alta, como 5:1 a 10:1, para aumentar a chance de uma ligadura bem-sucedida.
Por que uma inserção mais longa precisa de mais DNA em massa?+
A razão molar é sobre o número de moléculas, não sobre sua massa. Um fragmento de inserção mais longo pesa mais por molécula, portanto, para adicionar o mesmo número de moléculas de inserção (e atingir a proporção molar alvo), você precisa proporcionalmente de mais nanogramas de DNA de inserção.
Devo pensar em massa (ng) ou quantidade molar (pmol)?+
A eficiência da ligação depende da razão molar entre o inserto e as moléculas do vetor, portanto a quantidade molar (pmol) é a quantidade que realmente importa biologicamente. Massa (ng) é o que você pode medir e pipetar, então esta calculadora converte entre os dois usando o comprimento de cada fragmento.
Quais unidades a Calculadora de Ligadura usa?+
A massa do vetor e a massa do inserto estão em nanogramas (ng). Os comprimentos do vetor e da inserção estão em pares de bases (pb). As quantidades molares são relatadas em picomoles (pmol). A razão molar em si é um número adimensional, como 3 para uma relação inserção:vetor de 3:1.
A proporção difere para ligaduras com extremidade romba e ligaduras com extremidade adesiva?+
Sim. As ligaduras de extremidade adesiva, que dependem de saliências complementares da digestão de restrição, são geralmente eficientes em uma proporção de inserção:vetor de 3:1. As ligaduras de extremidade cega não possuem saliências para guiar o recozimento e são menos eficientes, por isso os biólogos moleculares geralmente usam uma proporção mais alta – geralmente de 5:1 a 10:1 – para compensar.
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