Conhecer o peso molecular de uma sequência de DNA ou RNA é o primeiro passo para a conversão entre massa, moles e número de cópias da molécula – números que surgem constantemente durante a preparação de ligações, padrões de qPCR ou transfecções. Esta calculadora fornece uma estimativa rápida e independente da sequência apenas a partir do comprimento e da encadeamento de sua sequência e, em seguida, encadeia essa estimativa em conversões de massa para mol e número de cópias.
Por que a estimativa não precisa da sequência real
O peso molecular exato de uma molécula de DNA ou RNA depende precisamente de quantas bases (A, T/U, G, C) ela contém, já que cada nucleotídeo tem uma massa ligeiramente diferente. Para a maioria dos propósitos práticos – clonagem, PCR, dosagem de transfecção – esse nível de precisão não é necessário. Em vez disso, esta calculadora usa a massa média por base (ou par de bases, para DNA de fita dupla) estabelecida por referências padrão de biologia molecular, que tem precisão de uma fração de percentual para sequências típicas. O pequeno ajuste fixo do grupo final (36,04 para dsDNA, 79 para ssDNA, 159 para RNA) é responsável pelos grupos terminais fosfato e hidroxila nas extremidades da molécula.
Por que dsDNA, ssDNA e RNA dão respostas diferentes para o mesmo comprimento
Uma molécula de DNA de fita dupla de 1.000 pares de bases contém 2.000 nucleotídeos individuais – duas fitas complementares – então sua massa por unidade (617,96 g/mol por pb) reflete ambas as fitas combinadas. Uma molécula de DNA ou RNA de fita simples com o mesmo comprimento numérico tem apenas metade do número total de nucleotídeos, portanto, sua massa é calculada por nucleotídeo único (303,7 g/mol/nt para ssDNA, 320,5 g/mol/nt para RNA). O RNA é ligeiramente mais pesado por nucleotídeo do que o ssDNA porque seu açúcar ribose carrega um átomo de oxigênio extra em comparação com a desoxirribose do DNA. Sempre confirme qual é o tipo de sua sequência antes de comparar os pesos moleculares entre os experimentos.
Do peso molecular ao número de cópias
Depois de saber o peso molecular, converter uma massa medida (de um espectrofotômetro, Qubit ou quantificação em gel) em uma quantidade molar é uma única divisão: mols = massa ÷ MW. A partir daí, multiplicar pelo número de Avogadro (6,022 × 10²³ moléculas por mol) dá o número de cópias – a contagem real de moléculas de DNA ou RNA em sua amostra. Essa cadeia de conversões é exatamente o que é necessário para preparar uma série de diluições para uma curva padrão de quantificação absoluta qPCR ou para calcular proporções molares para uma reação de ligação.