Calcule o número de moléculas de DNA (número de cópias) a partir da massa e do comprimento de um fragmento, depois converta em cópias por microlitro e construa uma série de diluições padrão qPCR.
Fragmento
Insira a massa, o comprimento e o encadeamento do seu fragmento de DNA para calcular o número de cópias da molécula.
Strandedness define a massa média por base (par) usada na fórmula.
Pares de bases (dsDNA) ou bases (ssDNA).
Massa total de DNA em nanogramas, por ex. de um espectrofotômetro ou leitura Qubit.
Resultado
—
Insira uma massa e comprimento acima para calcular o número de cópias.
Volume de amostra
Usa a mesma massa, comprimento e tipo da guia Número de cópia, dividido pelo volume em que sua amostra está dissolvida.
Volume total em que a massa do fragmento (da guia Número de Cópia) é dissolvida.
Resultado
—
Insira um volume acima para calcular cópias por µL.
Série de diluição
Constrói uma série de diluições em série para uma curva padrão qPCR, começando pela concentração de cópias puras/µL na guia Cópias por µL.
A diluição dobrada é aplicada uma em cada etapa (10 é padrão para curvas padrão qPCR).
Número de pontos da curva padrão, incluindo o estoque puro (não diluído).
Resultado
—
Insira um volume na guia Cópias por μL para construir a série de diluição.
Passo
Cópias/µL
—
4 min de leitura4 etapas7 termos3 exemplos6 perguntascopies = (mass_ng × 10⁻⁹ × 6.022 × 10²³) / (length × 660)
A quantificação absoluta por qPCR depende da comparação de uma amostra desconhecida com uma curva padrão de contagens de moléculas conhecidas, não apenas de massa conhecida.
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Etapas
Como usar esta calculadora
4 etapas▸
1
Escolha tipo, comprimento e massa
Na guia Número de cópia, selecione dsDNA ou ssDNA, insira o comprimento do fragmento em pares de bases (ou bases para ssDNA) e insira a massa em nanogramas – por exemplo, de uma leitura de Qubit ou espectrofotômetro.
2
Leia o número da cópia
O cartão de resultados é atualizado instantaneamente, mostrando o número total de moléculas de DNA em notação científica, calculado a partir da massa e da massa média por par de bases.
3
Converter para cópias por µL
Mude para a guia Cópias por µL e insira o volume em que sua amostra está dissolvida. A calculadora divide o número total de cópias da etapa 2 por esse volume.
4
Construa uma série de diluições qPCR
Na guia padrão qPCR, defina um fator de diluição (10 é o padrão) e uma série de etapas para gerar uma tabela de diluição serial para uma curva padrão de quantificação absoluta qPCR.
A massa em nanogramas é convertida em gramas, multiplicada pelo número de Avogadro (moléculas por mol) e dividida pelo peso molecular total do fragmento (comprimento × massa média por par de bases). dsDNA usa 660 g/mol por par de bases; O ssDNA usa 330 g/mol por base, uma vez que uma única fita tem aproximadamente metade da massa de um par de bases.
Cópias por microlitro
copies/µL = total copies ÷ volume (µL)
Dividir o número total de cópias pelo volume em que a amostra é dissolvida dá a concentração em cópias por microlitro - a unidade em que as curvas padrão qPCR são normalmente expressas.
série de diluição serial qPCR
Cₙ = C₁ / factor^(n-1)
A partir da concentração de cópias puras (não diluídas)/µL (C₁), cada ponto sucessivo da curva padrão é diluído pelo mesmo fator de dobra - 10 vezes é o padrão, dando a cada ponto um log menor em concentração do que o anterior.
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Glossário
Principais termos explicados
7 termos▸
Copiar númeroO número total de moléculas individuais de DNA presentes em uma amostra, calculado a partir de sua massa e do peso molecular de uma única molécula usando o número de Avogadro.
dsDNADNA de fita dupla. O comprimento é medido em pares de bases (pb); esta calculadora usa uma massa média de 660 g/mol por par de bases.
Par de bases (pb)Dois nucleotídeos complementares (AT ou GC) unidos entre as duas fitas de DNA de fita dupla – a unidade padrão para medir o comprimento do fragmento de dsDNA.
Número de AvogradoO número de moléculas em um mol de uma substância, 6,022 × 10²³. Multiplicar moles de DNA por esta constante dá a contagem total de moléculas.
Massa média de bpO peso molecular médio contribuído por um par de bases (ou, para DNA de fita simples, uma base) — aproximadamente 660 g/mol para dsDNA e 330 g/mol para ssDNA. Esta aproximação independente da sequência é padrão em toda a biologia molecular, embora o valor exato varie ligeiramente com a composição da base.
qPCRPCR quantitativo (em tempo real) — uma técnica que mede a amplificação do DNA à medida que ela acontece, frequentemente usada para determinar o número absoluto de cópias de uma sequência alvo em uma amostra desconhecida, comparando-a com uma curva padrão de diluições de concentração conhecida.
PlasmídeoUma pequena molécula de DNA circular de fita dupla, separada do DNA cromossômico, comumente usada para transportar um gene de interesse e frequentemente usada para preparar padrões de número de cópias qPCR porque seu tamanho e sequência exatos são conhecidos.
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Situações comuns
Exemplos práticos
3 exemplos▸
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Quantificando uma preparação de plasmídeo
100 ng de um fragmento de dsDNA de 1.000 pb
Tipo dsDNAComprimento 1.000 pbMissa 100 ng
cópias = (100 × 10⁻⁹ × 6,022 × 10²³) / (1.000 × 660) ≈ 9,12 × 10¹⁰ cópias. Esta é a contagem total de moléculas em toda a amostra de 100 ng, antes de contabilizar o volume em que está dissolvida.
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Convertendo para uma concentração de trabalho
A mesma amostra de 100 ng, dissolvida em 50 µL
Total de cópias ≈ 9,12 × 10¹⁰Volume 50 µL
cópias/µL = 9,12 × 10¹⁰ ÷ 50 ≈ 1,82 × 10⁹ cópias/µL. Essa concentração é o que você carregaria em uma reação qPCR ou usaria como o ponto perfeito de uma curva padrão.
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Construindo uma curva padrão qPCR
Série de diluição de 10 vezes, 7 pontos, começando em 1,82 × 10⁹ cópias/µL
Concentração pura 1,82 × 10⁹ cópias/µLFator de diluição 10Passos 7
Cada etapa divide a concentração anterior por 10, terminando em ≈ 1,82 × 10³ cópias/μL no ponto 7 — um spread de seis log que é típico para estabelecer uma curva padrão qPCR confiável.
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Referência
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APA e MLA▸
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MLA
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Análise detalhada
Da massa às moléculas: número de cópias de DNA e padrões qPCR
A quantificação absoluta por qPCR depende da comparação de uma amostra desconhecida com uma curva padrão de contagens de moléculas conhecidas, não apenas de massa conhecida. Converter a massa de um fragmento de DNA em seu número real de cópias – e depois em uma série de diluições – é o cálculo que une um espectrofotômetro ou leitura de Qubit a uma curva padrão utilizável.
Por que o número de cópias é mais importante do que apenas a massa
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Duas amostras de DNA com a mesma massa podem conter números muito diferentes de moléculas se os comprimentos dos fragmentos diferirem — um fragmento curto de 200 pb tem muito mais moléculas por nanograma do que um fragmento de 10.000 pb da mesma massa, uma vez que cada molécula individual pesa menos. Para curvas padrão qPCR, o que importa é a contagem real de moléculas (número de cópias), porque os valores de Ct rastreiam quantas cópias alvo estão presentes, e não quantos nanogramas. Esta calculadora converte massa e comprimento em número de cópias usando o número de Avogadro, a mesma constante usada para qualquer conversão de mol em molécula em química.
Por que dsDNA e ssDNA usam massas médias diferentes
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O comprimento da fita dupla do DNA é medido em pares de bases, onde cada unidade já representa ambas as fitas complementares, de modo que a aproximação padrão de 660 g/mol por par de bases reflete a massa combinada de ambas as fitas. O comprimento do DNA de fita simples é medido por base individual, então sua massa média (330 g/mol por base) é aproximadamente metade da de um par de bases – é a massa do nucleotídeo de apenas uma fita. Usar a configuração de encalhamento errada para o seu tipo de amostra produzirá um número de cópias errado por aproximadamente um fator de dois.
Construindo uma série de diluições seriais para uma curva padrão
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Uma curva padrão qPCR é construída amplificando várias diluições de concentração conhecida de um modelo de referência - geralmente um plasmídeo linearizado ou produto de PCR - e plotando seus valores de Ct em relação ao log (número de cópias). Uma diluição em série de 10 vezes em 6–8 pontos é a escolha convencional, uma vez que abrange várias ordens de grandeza, mantendo ao mesmo tempo o número de reações gerenciável. Depois de saber a concentração pura em cópias/µL, cada padrão subsequente é simplesmente o anterior diluído pelo mesmo fator, que é exatamente o que a guia Padrão qPCR calcula.
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Perguntas
Perguntas frequentes
6 perguntas▸
Qual fórmula a Calculadora de Número de Cópia de DNA usa?+
cópias = (massa em ng × 10⁻⁹ × número de Avogadro) / (comprimento × massa média por bp ou base). O número de Avogadro é 6,022 × 10²³ moléculas por mol. dsDNA usa 660 g/mol por par de bases; ssDNA usa 330 g/mol por base.
Que massa média por par de bases esta calculadora usa e por quê?+
660 g/mol por par de bases para dsDNA e 330 g/mol por base para ssDNA. Estas são aproximações padrão independentes de sequência usadas em toda a biologia molecular; o valor exato para uma sequência real varia ligeiramente (aproximadamente 650-660 g/mol/bp) dependendo de sua composição precisa de A/T/G/C.
Por que eu precisaria de uma curva padrão qPCR?+
O qPCR em tempo real mede os ciclos de amplificação (valores Ct), não as contagens de moléculas diretamente. Para determinar o número absoluto de cópias alvo em uma amostra desconhecida, você compara seu valor Ct com uma curva padrão construída a partir de diluições em série de um modelo de referência com números de cópias conhecidos – que é exatamente o que a guia Padrão qPCR ajuda a construir.
Quais unidades o resultado usa?+
A guia Número de Cópia informa o número total de moléculas de DNA (uma contagem simples, mostrada em notação científica, pois os números são muito grandes). A guia Cópias por µL informa a mesma contagem dividida pelo volume da sua amostra, em cópias por microlitro — a unidade padrão para concentrações da curva padrão qPCR.
Qual a diferença entre o ssDNA e o dsDNA nesta calculadora?+
Selecione ssDNA se sua amostra for de fita simples (por exemplo, um oligo sintético ou genoma de vírus ssDNA) e insira seu comprimento em bases em vez de pares de bases. A calculadora então usa 330 g/mol por base em vez de 660 g/mol por par de bases, uma vez que um único fio carrega aproximadamente metade da massa de um par de bases.
Como faço para converter meu número total de cópias em cópias por µL?+
Insira o volume em que seu DNA está dissolvido (em microlitros) na guia Cópias por µL. A calculadora divide o número total de cópias da guia Número de Cópias por esse volume para fornecer a concentração em cópias/µL, que você pode então transportar para a guia Padrão qPCR.
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