Calculadora de concentração de DNA

Calcule a concentração de DNA ou RNA a partir de uma leitura do espectrofotômetro A260, com o fator de diluição e a razão de pureza 260/280.

Converta a leitura de absorbância A260 de um espectrofotômetro em uma concentração de ácido nucleico: C = A260 × fator × diluição. O fator depende do tipo de ácido nucleico.

Leitura ONU260

Absorvância a 260 nm (sem unidade, por exemplo, de um NanoDrop).

Tipo de ácido nucleico

Fator de diluição

1 se estiver lendo a amostra não diluída.

Leitura UN280 - opcional

Adicione isso para ver também a proporção de pureza 260/280.

Resultado

—

Insira valores para calcular.

Concentração—

Pureza 260/280—

Como lido (sem escala)—

5 min de leitura 3 etapas 7 termos 3 exemplos 6 perguntas C = A260 × fator × diluição

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Etapas

Como usar esta calculadora

3 etapas

Insira sua leitura A260 e tipo de ácido nucleico

Na guia Concentração, insira a absorbância a 260 nm (A260) do seu espectrofotômetro ou leitura do NanoDrop e selecione o tipo de ácido nucleico — dsDNA, ssDNA ou RNA — já que cada um tem um fator de conversão diferente. Se você ler uma amostra diluída, insira também o fator de diluição (deixe-o em 1 para uma leitura não diluída).

Leia a concentração e pureza

O cartão de resultados mostra a concentração em ng/µL (equivalente a µg/mL) juntamente com uma interpretação em linguagem simples. Adicione uma leitura A280 no campo opcional para ver também a taxa de pureza 260/280 e se ela está próxima do valor ideal para o seu tipo de amostra.

Use as guias Pureza ou Diluição para outros ângulos

Mude para a guia Pureza (260/280) para verificar a pureza da amostra por conta própria do A260 e A280 sem precisar de um fator de diluição, ou use a guia Diluição para dimensionar uma leitura de amostra diluída de volta à concentração do estoque original. Tudo é atualizado instantaneamente – não há botão de cálculo.

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Referência

Fórmula e metodologia

3 fórmulas

Concentração do A260

C = A260 × fator × diluição

A concentração de ácido nucleico é proporcional à sua absorvância a 260 nm (lei de Beer-Lambert). O fator converte uma unidade de absorbância (1,0 OD260, usando um comprimento de caminho padrão de 1 cm) em uma concentração de massa: 50 µg/mL para DNA de fita dupla (dsDNA), 33 µg/mL para DNA de fita simples (ssDNA) e 40 µg/mL para RNA. Multiplique pelo fator de diluição se a amostra foi diluída antes da leitura. O resultado em µg/mL é numericamente idêntico a ng/µL.

Razão de pureza 260/280

Pureza = A260 / A280

As proteínas absorvem mais fortemente perto de 280 nm, enquanto os ácidos nucleicos absorvem mais fortemente perto de 260 nm, de modo que a proporção das duas leituras indica quanta proteína ou outro contaminante está misturado com o ácido nucleico. O DNA de fita dupla puro apresenta leituras próximas a 1,8; o RNA puro tem uma leitura próxima de 2,0 porque a diferente composição de bases e a estrutura de fita simples do RNA mudam sua absorbância um pouco mais para cima.

Dimensionando uma leitura diluída

C_undiluted = A260 × factor × dilution

Quando uma amostra está muito concentrada para ser lida com precisão (A260 acima de aproximadamente 1,0–2,0 perde linearidade na maioria dos instrumentos), ela é diluída antes da leitura. Multiplicar o A260 diluído pelo fator de diluição recupera a concentração do estoque original não diluído.

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Glossário

Principais termos explicados

7 termos

A260 A absorvância de uma amostra num comprimento de onda de 260 nanómetros, o ponto onde os ácidos nucleicos (ADN e ARN) absorvem a luz UV com mais força. É a medição primária que um espectrofotômetro ou NanoDrop faz para estimar a concentração de ácido nucleico.

Espectrofotometria Uma técnica que mede a quantidade de luz de um comprimento de onda específico que uma amostra absorve, usada aqui para estimar a concentração e a pureza do ácido nucleico a partir da absorvância de UV em 260 nm e 280 nm.

fator dsDNA A constante de conversão de 50 µg/mL por unidade de A260, usada para DNA de fita dupla. Ele reflete a intensidade com que uma amostra padrão de DNA de dupla hélice absorve luz de 260 nm por unidade de concentração.

Razão de pureza A proporção de absorbância em dois comprimentos de onda (mais comumente A260/A280) usada para estimar o grau de contaminação de uma amostra de ácido nucleico com proteína ou outro material que absorve UV. Mais próximo do valor ideal significa uma amostra mais pura.

260/280 Abreviação da razão de absorção A260/A280, a verificação de pureza padrão para DNA ou RNA extraído. Uma proporção baixa (bem abaixo de 1,8) geralmente sinaliza contaminação por proteínas ou fenol proveniente da extração.

Fator de diluição Quantas vezes uma amostra foi diluída antes de ser lida no espectrofotômetro — um fator de diluição de 10 significa que 1 parte de amostra foi misturada com 9 partes de tampão. Multiplicar o resultado da leitura diluída por este fator recupera a concentração da amostra original.

NanoDrop Uma marca comum de espectrofotômetro de microvolume usado em laboratórios de biologia molecular para medir A260, A280 e concentração e pureza de ácido nucleico derivado de apenas 1–2 µL de amostra sem cubeta.

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Situações comuns

Exemplos práticos

3 exemplos

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Verificando uma minipreparação de plasmídeo

Concentração básica de dsDNA

Leitura A260 0.5 Tipo de ácido nucleico dsDNA Fator de diluição 1

C = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL. Um A260 de 0,5 para uma amostra de dsDNA não diluída fornece uma concentração de 25 ng/µL – um rendimento típico para uma minipreparação de plasmídeo.

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Lendo uma preparação concentrada de DNA genômico após diluição

Dimensionando uma leitura diluída

Leitura A260 (diluída) 0.6 Tipo de ácido nucleico dsDNA Fator de diluição 10

C = 0,6 × 50 × 10 = 300 ng/µL. Uma diluição de 1:10 foi lida para permanecer dentro da faixa linear do instrumento; a escala pelo fator de diluição mostra que o estoque não diluído é de 300 ng/µL.

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Verificando a pureza antes do sequenciamento

Razão de pureza 260/280

Leitura A260 0.5 Leitura A280 0.28 Tipo de ácido nucleico dsDNA

Pureza = 0,5 / 0,28 = 1,79 — bem no ideal ~1,8 para dsDNA, indicando uma preparação limpa com contaminação mínima de proteínas, adequada para sequenciamento ou clonagem downstream.

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Referência

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Análise detalhada

Como calcular a concentração de DNA a partir de uma leitura A260

5 capítulos · 5 min de leitura

Estimar a quantidade de DNA ou RNA presente em uma amostra é uma das primeiras verificações em quase todos os fluxos de trabalho de biologia molecular — antes da clonagem, sequenciamento, PCR ou transfecção. Os espectrofotômetros modernos e os instrumentos NanoDrop tornam isso rápido, mas a interpretação correta dos números ainda depende da compreensão do que A260, o fator de conversão e a taxa de pureza 260/280 realmente significam.

Por que o A260 mede a concentração de ácido nucleico

O DNA e o RNA absorvem mais fortemente a luz ultravioleta em torno de 260 nanômetros, em grande parte devido aos anéis aromáticos em suas bases de nucleotídeos. De acordo com a lei de Beer-Lambert, a absorbância é diretamente proporcional à concentração para um comprimento de caminho fixo, portanto, uma leitura do espectrofotômetro a 260 nm (A260) pode ser convertida em uma concentração, uma vez que você conheça a constante de proporcionalidade correta para o tipo de ácido nucleico que você está medindo.

Por que o fator difere por tipo de ácido nucleico

O fator de conversão – 50 µg/mL por unidade A260 para DNA de fita dupla, 33 µg/mL para DNA de fita simples e 40 µg/mL para RNA – difere porque essas moléculas absorvem luz de 260 nm de maneira ligeiramente diferente por unidade de massa. O empilhamento de bases de dupla hélice no dsDNA reduz um pouco sua absorbância em comparação com fitas simples não estruturadas, razão pela qual o ssDNA e o RNA (ambos normalmente menos pareados de bases em solução) têm fatores por massa mais baixos. Usar o fator errado para o seu tipo de amostra é uma das fontes mais comuns de uma estimativa de concentração imprecisa.

Lendo a proporção de pureza 260/280

As proteínas absorvem a luz UV mais fortemente em torno de 280 nm por causa de aminoácidos aromáticos como triptofano e tirosina, enquanto os ácidos nucléicos absorvem mais fortemente em 260 nm. A comparação das duas absorvâncias (A260/A280) dá, portanto, uma estimativa rápida da quantidade de contaminação proteica que permanece numa amostra extraída. Uma proporção próxima de 1,8 é considerada DNA de fita dupla puro; uma proporção próxima de 2,0 é considerada RNA puro. Razões visivelmente abaixo desses valores geralmente apontam para sobras de proteína ou fenol do processo de extração, enquanto proporções visivelmente acima podem indicar contaminação de RNA em uma preparação de DNA ou amostra degradada.

Por que a diluição é importante para leituras precisas

As leituras de absorbância do espectrofotômetro só são lineares de forma confiável com concentrações até aproximadamente A260 de 1,0–2,0, dependendo do instrumento. Amostras mais concentradas do que isso devem ser diluídas antes da leitura e, em seguida, a concentração calculada da leitura diluída multiplicada pelo fator de diluição para recuperar a concentração do estoque original - que é exatamente o que a guia Diluição desta calculadora automatiza.

Limitações das estimativas baseadas no A260

As estimativas baseadas em A260/A280 são rápidas e convenientes, mas são menos precisas do que os métodos de quantificação baseados em fluorescência (como os ensaios PicoGreen ou Qubit), que se ligam especificamente ao DNA de fita dupla e são muito menos sensíveis à contaminação de RNA, nucleotídeos livres ou proteínas. Para aplicações com requisitos rígidos de quantificação, como preparação de biblioteca de sequenciamento de próxima geração, os laboratórios geralmente confirmam uma estimativa baseada em NanoDrop com um ensaio baseado em fluorescência antes de prosseguir.

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Perguntas

Perguntas frequentes

6 perguntas

Qual é a fórmula de concentração de DNA de uma leitura de A260?+

A concentração (em µg/mL, equivalente a ng/µL) é igual à leitura de absorbância do A260 multiplicada por um fator de conversão para o tipo de ácido nucleico, multiplicado pelo fator de diluição: C = A260 × fator × diluição. O fator é 50 para DNA de fita dupla, 33 para DNA de fita simples e 40 para RNA.

Qual é o fator de conversão do dsDNA e por que é 50?+

O fator dsDNA é 50 µg/mL por unidade de A260 – uma constante determinada empiricamente que reflete a intensidade com que o DNA de fita dupla absorve luz a 260 nm por unidade de concentração de massa, assumindo um comprimento de caminho padrão do espectrofotômetro de 1 cm.

Qual é a aparência da proporção 260/280 de uma amostra de DNA puro?+

Uma proporção de 260/280 em torno de 1,8 é geralmente considerada pura para DNA de fita dupla. Razões bem abaixo de 1,8 sugerem contaminação por proteínas ou fenol; proporções acima de 1,9–2,0 podem sugerir contaminação de RNA em uma preparação de DNA.

Por que o alvo de pureza do RNA é diferente, em ~2,0?+

O RNA é predominantemente de fita simples e tem uma composição de base diferente do DNA de fita dupla, ambos mudando sua absorbância por massa em 260 nm em relação a 280 nm, um pouco mais alta do que o dsDNA - portanto, uma amostra de RNA puro normalmente lê mais perto de uma proporção de 260/280 de 2,0.

Quais unidades esta calculadora usa?+

A260 e A280 são valores de absorbância sem unidade. A concentração de saída é dada em ng/µL, que é numericamente idêntica a µg/mL. A proporção de pureza 260/280 também não tem unidade – é simplesmente o quociente das duas leituras de absorbância.

Por que minha amostra pode apresentar contaminação mesmo após uma extração limpa?+

Uma proporção baixa de 260/280 geralmente aponta para proteína residual ou fenol dos reagentes de extração, em vez de uma falha na preparação – reprecipitar ou repurificar a amostra (por exemplo, com uma lavagem adicional com etanol ou limpeza da coluna) geralmente resolve o problema. Leituras gerais de absorbância muito baixas também podem tornar a relação ruidosa, uma vez que tanto A260 quanto A280 são números pequenos próximos ao piso de medição do instrumento.

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