Hukum Beer-Lambert adalah persamaan di balik setiap pembacaan spektrofotometer UV-Vis: serapan meningkat berbanding lurus dengan seberapa banyak zat penyerap cahaya berada di jalur cahaya. Begitulah cara ahli kimia mengubah pengukuran transmisi cahaya sederhana menjadi konsentrasi yang tepat, dan ini mendasari teknik mulai dari kuantifikasi protein hingga pengujian kualitas air.

Bagaimana rumusnya bekerja

Ketika cahaya melewati suatu larutan, setiap molekul spesies penyerap mempunyai peluang untuk mencegat foton. Gandakan konsentrasinya, dan Anda menggandakan jumlah molekul dalam jalur cahaya - tetapi karena serapan bertambah secara eksponensial saat cahaya bergerak lebih dalam ke dalam sampel, pengukuran praktis (absorbansi) ditentukan pada skala logaritmik sehingga tetap linier terhadap konsentrasi dan panjang jalur. Hal itulah yang ditangkap oleh A = ε·l·c: skala serapannya linear dengan konsentrasi dan jarak yang ditempuh cahaya melalui sampel, dan absorptivitas molar ε adalah konstanta proporsionalitas yang bergantung pada zat tertentu dan panjang gelombang.

Karena hubungannya linier, maka dapat dibalik dengan bebas — kalkulator menggunakan persamaan yang sama untuk menyelesaikan satu persamaan yang tidak diketahui setelah Anda memasukkan tiga persamaan lainnya.

Masukan dan artinya

Absorbansi (A) tidak memiliki satuan dan biasanya dibaca langsung dari spektrofotometer; pembacaan yang dapat diandalkan biasanya antara 0,1 dan 1,0 — di atas sekitar 1,5–2, cahaya yang menyimpang dan ketidaklinieran instrumen membuat hukum menjadi kurang akurat, jadi encerkan sampel daripada mempercayai pembacaan yang sangat tinggi. Absorptivitas molar (ε) adalah konstanta spesifik zat dan panjang gelombang yang dipublikasikan (dalam L·mol⁻¹·cm⁻¹) — carilah senyawa spesifik dan panjang gelombang Anda daripada menggunakan kembali nilai dari pengujian yang berbeda. Panjang jalur (l) cocok dengan kuvet Anda, hampir selalu 1 cm kecuali Anda menggunakan mikrokuvet khusus. Konsentrasi (c) dalam mol/L; untuk sampel biologis yang sangat encer, angka ini seringkali sangat kecil seperti 10⁻⁵ atau 10⁻⁶ M.

Batasan dan kasus tepi

Hukum Beer-Lambert mengasumsikan larutan encer, homogen, dan tidak berhamburan yang diukur dengan cahaya monokromatik — larutan terurai pada konsentrasi tinggi saat molekul mulai berinteraksi satu sama lain, dan dalam sampel dengan partikulat atau kekeruhan yang menyebarkan cahaya selain menyerapnya. Dalam praktiknya, sebagian besar laboratorium tidak menghitung ε secara langsung; sebaliknya mereka membuat kurva kalibrasi dari beberapa standar yang diketahui dan menggunakan kemiringan serta intersepnya untuk membaca konsentrasi yang tidak diketahui, yang merupakan hal yang diotomatisasi oleh tab Kalibrasi. Jika pembacaan absorbansi Anda untuk standar yang diketahui tidak berada pada garis lurus, itu merupakan sinyal bahwa pengujian telah melampaui rentang valid yang berlaku.