What is the formula for protein concentration from A280?

Using a molar extinction coefficient: C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × path length)] × molecular weight. Using a mass-based extinction coefficient (no molecular weight needed): C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × path length). Both come from the Beer-Lambert law, A = ε × l × c.

Why does A280 measure protein concentration?

The aromatic amino acids tryptophan and tyrosine (and, more weakly, phenylalanine and cystine/disulfide bonds) absorb ultraviolet light most strongly around 280 nanometers. Since absorbance is proportional to concentration under the Beer-Lambert law, measuring A280 lets you estimate how much protein is present.

What's the difference between a molar and a mass extinction coefficient?

A molar extinction coefficient (M⁻¹cm⁻¹) is absorbance per mole of protein and needs the molecular weight to convert to a mass concentration. A mass extinction coefficient ((mg/mL)⁻¹cm⁻¹, sometimes published as ε(0.1%) or E1%₂₈₀) is absorbance per unit mass concentration and gives mg/mL directly, with no molecular weight required.

What is a standard curve and when should I use one?

A standard curve is a calibration line built from the measured absorbance of several samples with known protein concentration (commonly BSA in a Bradford or BCA assay). It's useful when you don't know your protein's extinction coefficient, or when working with a mixture of proteins (like a crude cell lysate) where a single extinction coefficient doesn't apply.

What units does this calculator use?

A280 and the standard-curve absorbance are unitless. Mass concentration is reported in mg/mL. Molar concentration, shown whenever a molecular weight is available, is reported in µM (micromolar). Molecular weight is entered in Daltons (Da), numerically equal to g/mol.

How do I use the dilution factor?

If your sample's absorbance is too high to read accurately (typically above an A280 of roughly 1.0–1.5), dilute it before reading, then enter the dilution factor — e.g. 10 for a 1:10 dilution — on the From A280 or Dilution tab. The calculator multiplies the diluted reading's concentration by the dilution factor to report the original, undiluted stock's concentration.

Kalkulator Konsentrasi Protein

Hitung konsentrasi protein dari pembacaan serapan A280 dan koefisien kepunahan (Beer-Lambert), atau dari metode kurva standar.

Ubah pembacaan serapan UV-Vis A280 menjadi konsentrasi protein menggunakan hukum Beer-Lambert: C = A280 / (ε × l). Pilih koefisien kepunahan molar (membutuhkan berat molekul) atau yang berbasis massa (tidak).

Pembacaan A280

Absorbansi pada 280 nm (tanpa unit).

Satuan koefisien kepunahan

Koefisien kepunahan (ε)

misalnya BSA ε280 ≈ 43,824 M⁻¹cm⁻¹.

Berat molekul (Da)

misalnya BSA ≈ 66.500 Hari. Diperlukan untuk molar ε.

Panjang jalur (cm)

Panjang jalur kuvet standar adalah 1 cm.

Faktor pengenceran

1 jika membaca sampel murni.

Hasil

—

Masukkan nilai untuk dihitung.

Konsentrasi—

Molar (µM)—

Seperti yang sudah dibaca (tanpa penskalaan)—

4 menit membaca 3 langkah 7 istilah 3 contoh 6 pertanyaan C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × l)] × MW

📋

Panduan langkah demi langkah

Cara menggunakan kalkulator ini

3 langkah

Pilih mode dan masukkan bacaan Anda

Pada tab Dari A280, masukkan pembacaan serapan A280 spektrofotometer Anda, pilih apakah koefisien kepunahan Anda adalah molar (M⁻¹cm⁻¹, memerlukan berat molekul) atau berdasarkan massa ((mg/mL)⁻¹cm⁻¹, tidak diperlukan berat molekul), dan masukkan nilai koefisien dan panjang jalur kuvet (1 cm untuk sebagian besar instrumen). Jika Anda bekerja dari kurva standar Bradford atau BCA, alihkan ke tab Kurva Standar dan masukkan kemiringan kurva dan potong bersama dengan serapan sampel Anda.

Baca konsentrasinya dalam mg/mL dan µM

Kartu hasil menunjukkan konsentrasi protein dalam mg/mL beserta interpretasi bahasa sederhana. Setiap kali berat molekul tersedia (selalu dalam mode molar, opsional dalam mode massa jika Anda juga memasukkannya), konsentrasi molar dalam µM juga ditampilkan — berguna untuk perhitungan stoikiometri atau pengikatan.

Gunakan tab Pengenceran untuk sampel yang diencerkan

Jika sampel Anda terlalu pekat untuk dibaca secara langsung, encerkan, baca A280 yang telah diencerkan, lalu gunakan tab Pengenceran untuk mengukur kembali pembacaan tersebut ke konsentrasi stok asli. Ini melaporkan nilai yang sudah dibaca (apa yang sebenarnya ada di dalam kuvet) dan konsentrasi stok yang ditingkatkan. Semuanya diperbarui secara instan — tidak ada tombol hitung.

⚡

Referensi

Rumus dan metodologi

4 rumus

Konsentrasi dari A280 (koefisien kepunahan molar)

C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × l)] × MW

Hukum Beer-Lambert menyatakan bahwa serapan sebanding dengan konsentrasi dan panjang lintasan: A = ε × l × c. Penyelesaian konsentrasi molar menghasilkan c (mol/L) = A280 / (ε_M × l), dengan ε_M adalah koefisien kepunahan molar dalam M⁻¹cm⁻¹ dan l adalah panjang jalur dalam cm (1 cm untuk kuvet standar). Mengalikan konsentrasi molar dengan berat molekul protein (MW, dalam g/mol atau Da) akan mengubah mol/L menjadi g/L, yang secara numerik identik dengan mg/mL — tidak diperlukan konversi satuan lebih lanjut.

Konsentrasi dari A280 (koefisien kepunahan massal)

C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × l)

Beberapa koefisien kepunahan yang dipublikasikan — sering diberi label ε(0,1%) atau E1%₂₈₀ — sudah dinyatakan dalam basis massa, dalam satuan (mg/mL)⁻¹cm⁻¹. Dalam hal ini konsentrasi massa langsung turun seperti Beer-Lambert tanpa memerlukan berat molekul sama sekali: C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × l). Berat molekul masih dapat diberikan setelahnya untuk melaporkan konsentrasi molar (µM).

Kurva standar

C = (A − intercept) / slope

Kurva standar (umumnya dibuat dengan uji Bradford atau BCA dan konsentrasi BSA yang diketahui) sesuai dengan garis lurus, serapan = kemiringan × konsentrasi + intersep, ke serangkaian standar konsentrasi yang diketahui. Setelah cocok, konsentrasi sampel yang tidak diketahui dibacakan dengan menyelesaikan konsentrasi berdasarkan serapan terukurnya.

Skala pengenceran

C_stock = C_as-read × dilution factor

Ketika sampel diencerkan sebelum pembacaan — diperlukan setelah absorbansi naik di atas sekitar 1,0–1,5, di mana linearitas spektrofotometer rusak — konsentrasi yang dihitung dari pembacaan yang diencerkan hanya menggambarkan sampel yang diencerkan. Mengalikannya dengan faktor pengenceran (misalnya 10 untuk pengenceran 1:10) akan memulihkan konsentrasi stok asli yang tidak diencerkan.

📖

Glosarium

Penjelasan istilah penting

7 istilah

Jumlah protein yang terlarut dalam volume larutan tertentu, paling sering dinyatakan dalam mg/mL (konsentrasi massa) atau µM/mol per liter (konsentrasi molar).

Absorbansi sampel pada panjang gelombang 280 nanometer, titik di mana asam amino aromatik triptofan, tirosin, dan fenilalanin (lemah) menyerap sinar UV. Ini adalah pengukuran standar, cepat, dan non-destruktif yang digunakan untuk memperkirakan konsentrasi protein.

Konstanta proporsionalitas (ε) yang menggambarkan seberapa kuat suatu zat menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Untuk protein dapat dinyatakan dalam basis molar (M⁻¹cm⁻¹, memerlukan berat molekul untuk mendapatkan konsentrasi massa) atau basis massa ((mg/mL)⁻¹cm⁻¹, menghasilkan konsentrasi massa secara langsung).

Hukum fisika yang menyatakan serapan berbanding lurus dengan konsentrasi dan panjang lintasan: A = ε × l × c. Ini mendasari setiap perkiraan konsentrasi spektrofotometri, termasuk kuantifikasi protein berbasis A280.

Konsentrasi molar (mol/L, atau µM pada tingkat rendah) menghitung molekul protein berapa pun ukurannya; konsentrasi massa (mg/mL) menimbang massa protein total. Konversi di antara keduanya memerlukan berat molekul protein: massa = molar × MW.

Garis kalibrasi dibuat dengan mengukur serapan beberapa sampel dengan konsentrasi protein yang diketahui (seringkali BSA), kemudian memasangkan garis (absorbansi vs. konsentrasi) yang digunakan untuk membaca konsentrasi sampel yang tidak diketahui dari serapan terukurnya.

Merek spektrofotometer volume mikro yang umum digunakan di laboratorium biologi molekuler dan biokimia untuk mengukur A280 dan memperoleh konsentrasi protein hanya dari 1–2 µL sampel tanpa kuvet tradisional.

👥

Skenario

Contoh dalam kehidupan nyata

3 contoh nyata

🧫

Mengukur persiapan lisozim yang dimurnikan

A280 dengan koefisien kepunahan molar

Pembacaan A280 0.5 Koefisien kepunahan (molar) 36000M⁻¹cm⁻¹ Berat molekul 14300 Hari

C = [0,5 / (36.000 × 1)] × 14.300 ≈ 0,199 mg/mL (≈13,9 µM). Koefisien kepunahan lisozim yang ditandai dengan baik menjadikan A280 cara yang cepat dan andal untuk memeriksa hasil setelah pemurnian.

🧪

Membaca hal yang tidak diketahui terhadap kurva standar BSA

Kurva standar (uji Bradford/BCA)

lereng 1.2 Mencegat 0.05 Absorbansi (tidak diketahui) 0.65

C = (0,65 − 0,05) / 1,2 = 0,5 mg/mL. Pengujian Bradford dan BCA tidak bergantung pada kandungan triptofan/tirosin, sehingga kurva standar sering kali lebih disukai untuk protein dengan komposisi asam amino yang tidak biasa.

🔬

Membaca sediaan antibodi pekat setelah pengenceran

Menskalakan pembacaan A280 yang diencerkan

Pembacaan A280 (diencerkan) 0.4 Koefisien kepunahan (molar) 43824 M⁻¹cm⁻¹ Berat molekul 66500 Hari Faktor pengenceran 10

Sampel yang diencerkan sendiri menunjukkan ≈0,607 mg/mL; pengenceran 1:10 dibaca agar tetap berada dalam rentang linier instrumen, sehingga penskalaan berdasarkan faktor pengenceran menunjukkan stok yang tidak diencerkan adalah ≈6,07 mg/mL.

🔗

Referensi

Sitasi kalkulator ini

APA & MLA

Gunakan salah satu format ini untuk menyitasi kalkulator dalam makalah, laporan, atau daftar sumber.

APA

MLA

📄

Ulasan mendalam

Cara Menghitung Konsentrasi Protein dari Pembacaan A280

5 bab · 4 menit membaca

Mengetahui dengan tepat berapa banyak protein dalam sampel — sebelum membuat gel, menyiapkan pengujian enzim, atau menormalkan Western blot — adalah salah satu pengukuran paling rutin di laboratorium biokimia atau biologi molekuler. Spektrofotometri UV pada 280 nm menjadikannya cepat dan tidak merusak, tetapi mendapatkan angka yang akurat bergantung pada pemilihan koefisien kepunahan yang tepat dan memahami apa yang sebenarnya diukur oleh hukum Beer-Lambert.

Mengapa A280 mengukur konsentrasi protein

Protein menyerap sinar ultraviolet paling kuat sekitar 280 nanometer karena rantai samping aromatik triptofan dan tirosin (dan, yang lebih lemah, ikatan fenilalanin dan disulfida). Berdasarkan hukum Beer-Lambert, serapan berbanding lurus dengan konsentrasi untuk panjang jalur tetap, sehingga dengan mengukur A280 Anda dapat menghitung kembali konsentrasi setelah mengetahui koefisien kepunahan sampel — konstanta proporsionalitas yang menghubungkan serapan dengan jumlah protein yang sebenarnya.

Koefisien molar vs. kepunahan massal

Koefisien kepunahan untuk protein dipublikasikan dalam dua konvensi berbeda. Koefisien kepunahan molar (ε_M, dalam M⁻¹cm⁻¹) menggambarkan serapan per mol protein dan memerlukan berat molekul protein untuk mengubah hasilnya menjadi konsentrasi massa (mg/mL). Koefisien kepunahan massal (sering diberi label ε(0,1%) atau E1%₂₈₀, dalam (mg/mL)⁻¹cm⁻¹) menggambarkan serapan per satuan konsentrasi massa secara langsung, melewatkan langkah berat molekul seluruhnya. Menggabungkan kedua konvensi tersebut — memasukkan nilai molar ke dalam rumus berbasis massa atau sebaliknya — adalah salah satu sumber kesalahan urutan besarnya yang paling umum dalam kuantifikasi protein.

Mengapa koefisien kepunahan teoretis bisa salah

Koefisien kepunahan molar biasanya dihitung secara teoritis dari rangkaian asam amino suatu protein — menghitung residu triptofan, tirosin, dan sistin (sistein terikat disulfida) dan menjumlahkan kontribusi per residu yang diketahui. Hal ini bekerja dengan baik untuk sebagian besar protein yang terlipat dengan baik dan larut, namun dapat memperkirakan serapan yang terlalu rendah atau berlebihan untuk protein dengan kofaktor terikat, terlipat yang tidak biasa, atau residu aromatik yang sedikit. Tag fusi, denaturan, dan pH juga dapat menggeser koefisien kepunahan sebenarnya dari nilai teoritis.

Kapan harus menggunakan kurva standar

Pengujian kolorimetri seperti Bradford (pengikatan pewarna Coomassie) dan BCA (asam bicinchoninic, reduksi tembaga) sama sekali tidak bergantung pada serapan UV suatu protein — pengujian ini mengukur perubahan warna yang sebanding dengan massa protein total, dikalibrasi berdasarkan kurva standar yang dibuat dari konsentrasi protein referensi yang diketahui, biasanya albumin serum sapi (BSA). Metode ini kurang sensitif terhadap komposisi asam amino protein tertentu dibandingkan A280, sehingga metode ini merupakan pemeriksaan silang yang baik — atau metode utama — untuk protein dengan sedikit residu triptofan/tirosin, atau untuk lisat mentah yang mengandung banyak protein berbeda sekaligus.

Keterbatasan estimasi berbasis A280

Pembacaan A280 cepat tetapi asumsikan sampel bebas dari kontaminan penyerap UV lainnya — asam nukleat khususnya menyerap dengan kuat pada 260 nm dan dapat merembes ke pembacaan 280 nm, sehingga meningkatkan konsentrasi protein yang terlihat. Sampel yang keruh atau partikulat menyebarkan cahaya dan juga meningkatkan pembacaan. Untuk penghitungan yang paling teliti, periksa silang estimasi berbasis A280 dengan uji kolorimetri (Bradford/BCA) atau, jika akurasi absolut paling penting, analisis asam amino.

❓

Pertanyaan

Pertanyaan umum

6 pertanyaan

Apa rumus konsentrasi protein dari A280?+

Menggunakan koefisien kepunahan molar: C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × panjang jalur)] × berat molekul. Menggunakan koefisien kepunahan berbasis massa (tidak diperlukan berat molekul): C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × panjang jalur). Keduanya berasal dari hukum Beer-Lambert, A = ε × l × c.

Mengapa A280 mengukur konsentrasi protein?+

Asam amino aromatik triptofan dan tirosin (dan, yang lebih lemah, ikatan fenilalanin dan sistin/disulfida) menyerap sinar ultraviolet paling kuat sekitar 280 nanometer. Karena serapan sebanding dengan konsentrasi berdasarkan hukum Beer-Lambert, pengukuran A280 memungkinkan Anda memperkirakan berapa banyak protein yang ada.

Apa perbedaan antara molar dan koefisien kepunahan massal?+

Koefisien kepunahan molar (M⁻¹cm⁻¹) adalah serapan per mol protein dan memerlukan berat molekul untuk mengubahnya menjadi konsentrasi massa. Koefisien kepunahan massal ((mg/mL)⁻¹cm⁻¹, terkadang diterbitkan sebagai ε(0,1%) atau E1%₂₈₀) adalah serapan per satuan konsentrasi massa dan menghasilkan mg/mL secara langsung, tanpa memerlukan berat molekul.

Apa itu kurva standar dan kapan saya harus menggunakannya?+

Kurva standar adalah garis kalibrasi yang dibuat dari pengukuran serapan beberapa sampel dengan konsentrasi protein yang diketahui (biasanya BSA dalam uji Bradford atau BCA). Ini berguna ketika Anda tidak mengetahui koefisien kepunahan protein Anda, atau ketika bekerja dengan campuran protein (seperti lisat sel mentah) di mana koefisien kepunahan tunggal tidak berlaku.

Satuan apa yang digunakan kalkulator ini?+

A280 dan kurva serapan standar tidak memiliki satuan. Konsentrasi massa dilaporkan dalam mg/mL. Konsentrasi molar, ditunjukkan setiap kali berat molekul tersedia, dilaporkan dalam µM (mikromolar). Berat molekul dimasukkan dalam Dalton (Da), yang secara numerik sama dengan g/mol.

Bagaimana cara menggunakan faktor pengenceran?+

Jika serapan sampel Anda terlalu tinggi untuk dibaca secara akurat (biasanya di atas A280 sekitar 1,0–1,5), encerkan sebelum dibaca, lalu masukkan faktor pengenceran — misalnya. 10 untuk pengenceran 1:10 — pada tab Dari A280 atau Pengenceran. Kalkulator mengalikan konsentrasi bacaan yang diencerkan dengan faktor pengenceran untuk melaporkan konsentrasi stok asli yang tidak diencerkan.

Unduh PDF satu halaman berisi hasil Anda. Masukkan alamat email untuk menerima kiat kalkulator sesekali. Tanpa spam, dan Anda dapat berhenti berlangganan kapan saja. Privasi.