Hitung jumlah DNA sisipan yang diperlukan untuk reaksi ligasi kloning dari jumlah vektor dan rasio molar sisipan:vektor yang diinginkan.
Vektor dan Sisipkan
Jumlah DNA vektor yang dicerna/dilinierkan yang digunakan dalam reaksi, dalam nanogram.
Panjang vektor yang dilinearisasi, berpasangan basa.
Panjang fragmen DNA yang akan disisipkan, berpasangan basa.
Kelebihan sisipan molar yang diinginkan dibandingkan vektor — 3:1 adalah titik awal yang umum untuk ligasi ujung lengket.
Contoh reaksi
Masukkan DNA yang Dibutuhkan
—
Masukkan massa vektor, panjang vektor/sisipan, dan rasio molar di atas untuk menghitung berapa banyak DNA sisipan yang akan ditambahkan.
Jumlah Molar
—
Vektor dan masukkan jumlah molar (pmol), panjangnya disesuaikan dengan massa yang Anda masukkan.
Ringkasan Reaksi
—
Ringkasan vektor dan masukkan jumlah untuk digabungkan dalam reaksi ligasi.
3 menit membaca3 langkah7 istilah3 contoh6 pertanyaaninsert ng = vector ng × (insert length bp / vector length bp)…
Membuat ligasi kloning berfungsi dengan andal dimulai dengan menambahkan jumlah sisipan molar yang tepat relatif terhadap vektor — bukan hanya massa sembarang.
📋
Panduan langkah demi langkah
Cara menggunakan kalkulator ini
3 langkah▸
1
Masukkan massa dan panjang vektor
Masukkan massa DNA vektor linier yang Anda gunakan (dalam ng) dan panjangnya (dalam pasangan basa). Ini berasal dari linearisasi pencernaan atau PCR Anda dan pembacaan konsentrasi berbasis NanoDrop atau gel.
2
Masukkan panjang sisipan dan rasio molar
Masukkan panjang fragmen sisipan (dalam bp) dan rasio molar sisipan:vektor target Anda — 3:1 adalah titik awal yang umum untuk ligasi ujung lengket. Kalkulator diperbarui secara instan.
3
Baca jumlah sisipan yang diperlukan
Tab Sisipkan Jumlah menunjukkan berapa nanogram sisipan yang akan ditambahkan; beralih ke Rasio Molar untuk melihat jumlah pmol, atau Pengaturan Reaksi untuk ringkasan gabungan kedua jumlah DNA.
⚡
Referensi
Rumus dan metodologi
1 rumus▸
Masukkan massa untuk rasio molar target
insert ng = vector ng × (insert length bp / vector length bp) × molar ratio
Karena fragmen DNA dengan panjang berbeda memiliki berat berbeda pada jumlah molar yang sama, massa sisipan memerlukan skala dengan rasio sisipan: panjang vektor dan kelebihan molar yang diinginkan dari sisipan terhadap vektor. Jumlah molar (pmol) diperoleh dari massa menggunakan massa rata-rata standar 660 g/mol per pasangan basa untuk DNA beruntai ganda.
📖
Glosarium
Penjelasan istilah penting
7 istilah▸
Penggabungan dua fragmen DNA secara enzimatik - biasanya vektor linier dan sisipan - menggunakan DNA ligase, yang membentuk ikatan fosfodiester yang menyatukan fragmen-fragmen tersebut.
Fragmen DNA yang diklon ke dalam vektor, seperti gen atau produk PCR, diukur di sini berdasarkan panjangnya pasangan basa dan massa yang ditambahkan ke dalam reaksi.
Tulang punggung DNA yang dilinearisasi (biasanya plasmid) tempat sisipan diikat, memberikan asal replikasi dan penanda yang dapat dipilih yang diperlukan untuk menyebarkan konstruksi yang dihasilkan.
Rasio molekul sisipan terhadap molekul vektor dalam reaksi ligasi, dinyatakan sebagai sisipan:vektor (misalnya 3:1). Rasio yang lebih tinggi meningkatkan peluang keberhasilan ligasi namun dapat meningkatkan latar belakang dari insert self-ligation.
Keseluruhan proses memasukkan fragmen DNA ke dalam vektor, mengubahnya menjadi bakteri, dan memilih koloni yang membawa konstruksi yang benar.
Satuan yang digunakan untuk mengukur panjang DNA beruntai ganda (bp). Panjang vektor dan sisipan dimasukkan dalam pasangan basa, karena massa fragmen berskala langsung dengan panjang.
Langkah setelah ligasi di mana DNA yang telah diikat dimasukkan ke dalam sel bakteri yang kompeten, yang kemudian mereplikasi konstruksinya dan memungkinkannya untuk dipilih pada pelat antibiotik.
👥
Skenario
Contoh dalam kehidupan nyata
3 contoh nyata▸
🧬
Mahasiswa biologi molekuler
sisipan 3:1:rasio vektor
Massa vektor (ng) 50Panjang vektor (bp) 3000Masukkan panjang (bp) 1000Rasio molar 3
Masukkan ng = 50 × (1000/3000) × 3 = 50 ng. Dengan vektor sepertiga panjang sisipan menghilangkan suku rasio panjang terhadap rasio molar, massa sisipan yang dibutuhkan sama dengan massa vektor — pemeriksaan kewarasan yang berguna untuk ligasi ujung lengket standar 3:1.
🧬
Mahasiswa biologi molekuler
Sisipan lebih panjang, rasio sama
Massa vektor (ng) 50Panjang vektor (bp) 3000Masukkan panjang (bp) 2500Rasio molar 3
Masukkan ng = 50 × (2500/3000) × 3 = 125 ng. Mempertahankan jumlah vektor yang sama dan rasio molar 3:1 tetapi menggunakan sisipan yang lebih panjang (2500 bp, bukan 1000 bp) akan menggandakan massa sisipan yang diperlukan lebih dari dua kali lipat, karena diperlukan lebih banyak massa DNA untuk mencapai jumlah molar yang sama dengan panjang yang lebih besar.
🧬
Mahasiswa biologi molekuler
Jumlah molar (ligasi 5:1)
Massa vektor (ng) 100Panjang vektor (bp) 5000Masukkan panjang (bp) 500Rasio molar 5
Vektor: 100 ng pada 5000 bp ≈ 0,030 pmol. Sisipan yang dibutuhkan: 50 ng pada 500 bp ≈ 0,152 pmol — tepat 5 kali jumlah molar vektor, sehingga menghasilkan rasio sisipan:vektor molar 5:1 terlepas dari perbedaan panjang fragmen.
🔗
Referensi
Sitasi kalkulator ini
APA & MLA▸
Gunakan salah satu format ini untuk menyitasi kalkulator dalam makalah, laporan, atau daftar sumber.
Membuat ligasi kloning berfungsi dengan andal dimulai dengan menambahkan jumlah sisipan molar yang tepat relatif terhadap vektor — bukan hanya massa sembarang. Kalkulator ini mengonversi rasio molar sisipan:vektor target menjadi nanogram sebenarnya dari sisipan DNA ke pipet, yang memperhitungkan pengaruh panjang fragmen terhadap konversi massa ke mol, dan menunjukkan jumlah molar yang mendasari kedua potongan DNA.
Cara kerja Kalkulator Ligasi
▸
DNA ligase menggabungkan ujung vektor linier yang kompatibel dan fragmen sisipan. Karena jumlah ujung yang dapat diikat tetap per molekul berapa pun panjangnya, efisiensi ligasi bergantung pada rasio molar molekul sisipan terhadap vektor — bukan rasio massanya. Kalkulator ini memulai dari massa dan panjang vektor Anda, menghitung jumlah molar vektor, lalu menghitung berapa banyak massa sisipan yang diperlukan untuk mencapai rasio molar target Anda menggunakan rasio sisipan:panjang vektor sebagai faktor penskalaan.
Jumlah molar diperoleh dari massa DNA menggunakan massa rata-rata standar 660 g/mol per pasangan basa untuk DNA beruntai ganda, konstanta yang sama digunakan pada Calculover lainnya Kalkulator kuantitas DNA (misalnya, Nomor Salinan DNA) sehingga hasilnya tetap konsisten.
Masukan dan artinya
▸
Massa vektor (ng) dan panjang vektor (bp) menggambarkan tulang punggung linierisasi yang Anda ukur dengan NanoDrop atau kuantifikasi gel setelah pencernaan restriksi atau linearisasi PCR. Panjang sisipan (bp) adalah ukuran fragmen yang akan dikloning. Rasio molar sisipan: vektor adalah kelebihan target molekul sisipan dibandingkan molekul vektor — 3:1 merupakan titik awal tipikal untuk ligasi ujung lengket (enzim restriksi), sedangkan ligasi ujung tumpul sering kali menggunakan rasio yang lebih tinggi (5:1 hingga 10:1) untuk mengimbangi efisiensi yang lebih rendah.
Panjang sisipan memiliki efek terbesar pada massa yang diperlukan: menggandakan panjang sisipan kira-kira dua kali lipat jumlah sisipan diperlukan pada rasio molar yang sama, karena diperlukan lebih banyak massa untuk mencapai jumlah molekul yang sama.
Batasan dan kasus tepi
▸
Kalkulator ini mengasumsikan DNA beruntai ganda standar dan massa rata-rata 660 g/mol/bp yang banyak digunakan — kalkulator ini tidak memperhitungkan variasi kandungan GC, sehingga sedikit menggeser berat molekul sebenarnya. Ligasi ujung tumpul biasanya memerlukan rasio molar yang lebih tinggi daripada ligasi ujung lengket untuk mencapai efisiensi yang sama karena ligasi tersebut tidak memiliki overhang komplementer; sesuaikan input rasio daripada mengandalkan satu default. Untuk rakitan multi-fragmen (Golden Gate atau Gibson) dengan lebih dari satu sisipan, jalankan kalkulator ini satu kali per fragmen terhadap jumlah vektor yang sama.
❓
Pertanyaan
Pertanyaan umum
6 pertanyaan▸
Apa rumus kalkulator ligasi?+
Sisipkan ng = vektor ng × (masukkan panjang bp / panjang vektor bp) × rasio molar. Rasio sisipan:panjang vektor menskalakan massa vektor untuk memperhitungkan ukuran sisipan, dan rasio molar menentukan berapa banyak molekul sisipan yang Anda inginkan per molekul vektor.
Sisipan: rasio molar vektor apa yang harus saya gunakan?+
3:1 adalah titik awal umum untuk ligasi ujung lengket (overhang yang kompatibel dengan enzim restriksi). Ligasi ujung tumpul umumnya kurang efisien dan sering kali menggunakan rasio yang lebih tinggi, seperti 5:1 hingga 10:1, untuk meningkatkan peluang keberhasilan ligasi.
Mengapa sisipan yang lebih panjang memerlukan lebih banyak DNA berdasarkan massa?+
Rasio molar adalah tentang jumlah molekul, bukan massanya. Fragmen sisipan yang lebih panjang memiliki berat lebih banyak per molekul, jadi untuk menambahkan jumlah molekul sisipan yang sama (dan mencapai rasio molar target), Anda memerlukan nanogram DNA sisipan yang lebih banyak secara proporsional.
Haruskah saya berpikir dalam satuan massa (ng) atau jumlah molar (pmol)?+
Efisiensi ligasi bergantung pada rasio molar molekul sisipan terhadap vektor, sehingga jumlah molar (pmol) adalah kuantitas yang benar-benar penting secara biologis. Massa (ng) adalah massa yang dapat Anda ukur dan dipipet, jadi kalkulator ini mengkonversi keduanya menggunakan panjang masing-masing fragmen.
Unit apa yang digunakan Kalkulator Ligasi?+
Massa vektor dan massa sisipan dinyatakan dalam nanogram (ng). Panjang vektor dan sisipan dalam pasangan basa (bp). Jumlah molar dilaporkan dalam pikomol (pmol). Rasio molar sendiri merupakan bilangan tak berdimensi, misalnya 3 untuk rasio sisipan:vektor 3:1.
Apakah rasionya berbeda untuk ligasi ujung tumpul vs. ujung lengket?+
Ya. Ligasi ujung lengket, yang mengandalkan overhang komplementer dari pencernaan restriksi, umumnya efisien pada rasio sisipan:vektor 3:1. Ligasi ujung tumpul tidak memiliki overhang untuk memandu anil dan kurang efisien, sehingga ahli biologi molekuler biasanya menggunakan rasio yang lebih tinggi — seringkali 5:1 hingga 10:1 — sebagai kompensasi.
📄
Simpan & bagikan
Dapatkan PDF hasil dengan merek Calculover
Unduh PDF satu halaman berisi hasil Anda. Masukkan alamat email untuk menerima kiat kalkulator sesekali. Tanpa spam, dan Anda dapat berhenti berlangganan kapan saja. Privasi.