Memperkirakan berapa banyak DNA atau RNA dalam sampel adalah salah satu pemeriksaan pertama di hampir setiap alur kerja biologi molekuler — sebelum kloning, pengurutan, PCR, atau transfeksi. Spektrofotometer modern dan instrumen NanoDrop mempercepat hal ini, namun menafsirkan angka-angka dengan benar masih bergantung pada pemahaman apa sebenarnya arti A260, faktor konversi, dan rasio kemurnian 260/280.

Mengapa A260 mengukur konsentrasi asam nukleat

DNA dan RNA menyerap sinar ultraviolet paling kuat sekitar 260 nanometer, sebagian besar disebabkan oleh cincin aromatik pada basa nukleotidanya. Berdasarkan hukum Beer-Lambert, serapan berbanding lurus dengan konsentrasi untuk panjang lintasan tetap, sehingga pembacaan spektrofotometer pada 260 nm (A260) dapat diubah menjadi konsentrasi setelah Anda mengetahui konstanta proporsionalitas yang tepat untuk jenis asam nukleat yang Anda ukur.

Mengapa faktor tersebut berbeda berdasarkan jenis asam nukleat

Faktor konversi — 50 µg/mL per unit A260 untuk DNA beruntai ganda, 33 µg/mL untuk DNA beruntai tunggal, dan 40 µg/mL untuk RNA — berbeda karena molekul-molekul ini menyerap cahaya 260 nm dengan cara yang sedikit berbeda per satuan massa. Penumpukan basa heliks ganda dalam dsDNA mengurangi serapannya dibandingkan dengan untaian tunggal tidak terstruktur, itulah sebabnya ssDNA dan RNA (keduanya biasanya memiliki pasangan basa yang lebih sedikit dalam larutan) memiliki faktor per massa yang lebih rendah. Menggunakan faktor yang salah untuk jenis sampel Anda adalah salah satu sumber paling umum dari perkiraan konsentrasi yang tidak akurat.

Membaca rasio kemurnian 260/280

Protein menyerap sinar UV paling kuat pada sekitar 280 nm karena asam amino aromatik seperti triptofan dan tirosin, sedangkan asam nukleat menyerap paling kuat pada 260 nm. Membandingkan dua serapan (A260/A280) memberikan perkiraan cepat berapa banyak kontaminasi protein yang tersisa dalam sampel yang diekstraksi. Rasio mendekati 1,8 dianggap sebagai DNA beruntai ganda murni; rasio mendekati 2,0 dianggap RNA murni. Rasio yang jauh di bawah nilai ini biasanya menunjukkan sisa protein atau fenol dari proses ekstraksi, sedangkan rasio yang jauh di atas dapat menunjukkan kontaminasi RNA dalam sampel DNA yang telah dipreparasi atau terdegradasi.

Mengapa pengenceran penting untuk pembacaan yang akurat

Pembacaan serapan spektrofotometer hanya linier dengan konsentrasi hingga sekitar A260 sebesar 1,0–2,0, bergantung pada instrumennya. Sampel yang lebih pekat dari itu harus diencerkan sebelum dibaca, lalu konsentrasi hasil penghitungan hasil pengenceran dikalikan dengan faktor pengenceran untuk mendapatkan kembali konsentrasi stok asli — yang merupakan hal yang diotomatisasi oleh tab Pengenceran kalkulator ini.

Keterbatasan estimasi berbasis A260

Perkiraan berbasis A260/A280 cepat dan mudah dilakukan, namun kurang tepat dibandingkan metode kuantifikasi berbasis fluoresensi (seperti pengujian PicoGreen atau Qubit), yang secara khusus mengikat DNA beruntai ganda dan kurang sensitif terhadap kontaminasi RNA, nukleotida bebas, atau protein. Untuk aplikasi dengan persyaratan kuantifikasi yang ketat — seperti persiapan perpustakaan pengurutan generasi berikutnya — laboratorium sering kali mengonfirmasi perkiraan berbasis NanoDrop dengan pengujian berbasis fluoresensi sebelum melanjutkan.