Calculateur de concentration des protéines

Calculez la concentration protéique à partir de l’absorbance A280 et du coefficient d’extinction selon Beer-Lambert, ou à partir d’une courbe étalon.

Convert a UV-Vis A280 absorbance reading into a protein concentration using the Beer-Lambert law: C = A280 / (ε × l). Choose a molar extinction coefficient (needs molecular weight) or a mass-based one (doesn't).

Mesure A280

Absorbance at 280 nm (unitless).

Unités du coefficient d’extinction

Coefficient d’extinction (ε)

e.g. BSA ε280 ≈ 43,824 M⁻¹cm⁻¹.

Masse moléculaire (Da)

e.g. BSA ≈ 66,500 Da. Required for molar ε.

Longueur de trajet (cm)

Standard cuvette path length is 1 cm.

Facteur de dilution

1 if reading the sample undiluted.

Résultat

—

Enter values to compute.

Concentration—

Molaire (µM)—

Mesurée (sans correction)—

5 min de lecture 3 étapes 7 termes 3 exemples 6 questions C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × l)] × MW

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Étapes

Comment utiliser cette calculatrice

3 étapes

Choisissez un mode et saisissez votre mesure

Dans l’onglet « À partir de A280 », saisissez l’absorbance A280 mesurée au spectrophotomètre. Indiquez si le coefficient d’extinction est molaire (M⁻¹cm⁻¹ ; masse moléculaire requise) ou massique ((mg/mL)⁻¹cm⁻¹ ; masse moléculaire facultative), puis saisissez sa valeur et la longueur de trajet dans la cuve (1 cm pour la plupart des instruments). Si vous utilisez plutôt une courbe étalon de Bradford ou BCA, passez à l’onglet « Courbe étalon » et saisissez sa pente et son ordonnée à l’origine, ainsi que l’absorbance de l’échantillon.

Consultez la concentration en mg/mL et en µM

La carte de résultat indique la concentration protéique en mg/mL et fournit une interprétation en langage courant. Lorsqu’une masse moléculaire est disponible (toujours en mode molaire, ou en mode massique si vous la saisissez), la concentration molaire en µM s’affiche également ; elle est utile pour les calculs de stœchiométrie ou de liaison.

Utilisez l’onglet « Dilution » pour les échantillons dilués

Si l’échantillon est trop concentré pour être mesuré directement, diluez-le, mesurez son absorbance A280, puis utilisez l’onglet « Dilution » pour retrouver la concentration de la solution mère initiale. Le résultat affiche la valeur mesurée (celle de la cuve) et la concentration reconstituée de la solution mère. Tout est mis à jour instantanément, sans bouton de calcul.

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Référence

Formule et méthodologie

4 formules

Concentration à partir de A280 (coefficient d’extinction molaire)

C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × l)] × MW

La loi de Beer-Lambert indique que l’absorbance est proportionnelle à la concentration et à la longueur de trajet : A = ε × l × c. En isolant la concentration molaire, on obtient c (mol/L) = A280 / (ε_M × l), où ε_M est le coefficient d’extinction molaire en M⁻¹cm⁻¹ et l la longueur de trajet en cm (1 cm pour une cuve standard). En multipliant la concentration molaire par la masse moléculaire de la protéine (MW, en g/mol ou Da), on convertit les mol/L en g/L, numériquement identiques aux mg/mL : aucune autre conversion d’unité n’est nécessaire.

Concentration à partir de A280 (coefficient d’extinction massique)

C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × l)

Certains coefficients d’extinction publiés — souvent notés ε(0.1 %) ou E1%₂₈₀ — sont déjà exprimés sur une base massique, en (mg/mL)⁻¹cm⁻¹. La concentration massique se déduit alors directement de la loi de Beer-Lambert, sans connaître la masse moléculaire : C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × l). Vous pouvez ensuite fournir une masse moléculaire pour afficher aussi la concentration molaire (µM).

Courbe étalon

C = (A − intercept) / slope

Une courbe étalon, généralement obtenue avec un dosage de Bradford ou BCA et des concentrations connues d’albumine sérique bovine (BSA), ajuste une droite aux valeurs d’absorbance en fonction de la concentration. Une fois la droite ajustée, la concentration d’un échantillon inconnu se déduit de son absorbance mesurée en isolant la concentration dans l’équation.

Correction de dilution

C_stock = C_as-read × dilution factor

Lorsqu’un échantillon est dilué avant la mesure — ce qui est nécessaire quand l’absorbance dépasse environ 1.0–1.5, plage où le spectrophotomètre perd sa linéarité — la concentration calculée à partir de la mesure diluée ne décrit que l’échantillon dilué. Multipliez-la par le facteur de dilution (par exemple 10 pour une dilution au 1:10) pour retrouver la concentration de la solution mère initiale, non diluée.

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Glossaire

Termes clés expliqués

7 termes

Concentration protéique Quantité de protéines dissoutes dans un volume donné de solution, généralement exprimée en mg/mL (concentration massique) ou en µM/mol par litre (concentration molaire).

A280 Absorbance d’un échantillon mesurée à une longueur d’onde de 280 nanomètres, où les acides aminés aromatiques tryptophane, tyrosine et, plus faiblement, phénylalanine absorbent les ultraviolets. C’est une mesure rapide et non destructive couramment utilisée pour estimer la concentration protéique.

Coefficient d’extinction Constante de proportionnalité (ε) qui décrit l’intensité d’absorption de la lumière par une substance à une longueur d’onde donnée. Pour les protéines, elle peut être molaire (M⁻¹cm⁻¹ ; une masse moléculaire est nécessaire pour obtenir la concentration massique) ou massique ((mg/mL)⁻¹cm⁻¹ ; elle fournit directement la concentration massique).

Loi de Beer-Lambert Loi physique selon laquelle l’absorbance est directement proportionnelle à la concentration et à la longueur de trajet : A = ε × l × c. Elle est à la base de toute estimation de concentration par spectrophotométrie, y compris la quantification des protéines par A280.

Concentration molaire et concentration massique La concentration molaire (mol/L, ou µM pour les faibles concentrations) compte les molécules de protéine quelle que soit leur taille ; la concentration massique (mg/mL) mesure leur masse totale. Le passage de l’une à l’autre nécessite la masse moléculaire de la protéine : masse = concentration molaire × MW.

Courbe étalon Droite d’étalonnage construite en mesurant l’absorbance de plusieurs échantillons dont la concentration protéique est connue (souvent de la BSA), puis en ajustant une droite absorbance-concentration. Elle permet de déduire la concentration d’échantillons inconnus à partir de leur absorbance mesurée.

NanoDrop Marque courante de spectrophotomètre à microvolume utilisée en biologie moléculaire et en biochimie pour mesurer A280 et en déduire la concentration protéique avec seulement 1–2 µL d’échantillon, sans cuve traditionnelle.

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Situations types

Exemples concrets

3 exemples

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Dosage d’une préparation purifiée de lysozyme

Mesure A280 avec un coefficient d’extinction molaire

Absorbance A280 0.5 Coefficient d’extinction (molaire) 36000 M⁻¹cm⁻¹ Masse moléculaire 14300 Da

C = [0.5 / (36,000 × 1)] × 14,300 ≈ 0.199 mg/mL (≈13.9 µM). Le coefficient d’extinction bien caractérisé du lysozyme fait de la mesure A280 une méthode rapide et fiable pour vérifier le rendement après purification.

🧪

Mesure d’un échantillon inconnu avec une courbe étalon de BSA

Courbe étalon (dosage Bradford/BCA)

Pente 1.2 Ordonnée à l’origine 0.05 Absorbance (échantillon inconnu) 0.65

C = (0.65 − 0.05) / 1.2 = 0.5 mg/mL. Les dosages Bradford et BCA ne dépendent pas de la teneur en tryptophane ou en tyrosine ; une courbe étalon est donc souvent préférable pour les protéines dont la composition en acides aminés est inhabituelle.

🔬

Mesure après dilution d’une préparation concentrée d’anticorps

Correction d’une mesure A280 après dilution

Mesure A280 (échantillon dilué) 0.4 Coefficient d’extinction (molaire) 43824 M⁻¹cm⁻¹ Masse moléculaire 66500 Da Facteur de dilution 10

La concentration de l’échantillon dilué est d’environ 0.607 mg/mL. Une dilution au 1:10 a permis de rester dans la plage linéaire de l’instrument ; après application du facteur de dilution, la solution mère non diluée a une concentration d’environ 6.07 mg/mL.

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Référence

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APA et MLA

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Analyse approfondie

Calculer la concentration protéique à partir d’une mesure A280

5 chapitres · 5 min de lecture

Connaître précisément la quantité de protéines d’un échantillon — avant une électrophorèse sur gel, un dosage enzymatique ou la normalisation d’un Western blot — est une mesure courante dans les laboratoires de biochimie et de biologie moléculaire. La spectrophotométrie UV à 280 nm est rapide et non destructive, mais la précision du résultat dépend du choix du coefficient d’extinction et de la compréhension de ce que mesure réellement la loi de Beer-Lambert.

Pourquoi A280 permet de mesurer la concentration protéique

Les protéines absorbent fortement la lumière ultraviolette autour de 280 nanomètres en raison des chaînes latérales aromatiques du tryptophane et de la tyrosine (et, plus faiblement, de la phénylalanine et des liaisons disulfure). Selon la loi de Beer-Lambert, pour une longueur de trajet fixe, l’absorbance est directement proportionnelle à la concentration. La mesure A280 permet donc de calculer la concentration à condition de connaître le coefficient d’extinction de l’échantillon, constante de proportionnalité qui relie l’absorbance à la quantité réelle de protéines.

Coefficients d’extinction molaires et massiques

Les coefficients d’extinction des protéines sont publiés selon deux conventions. Un coefficient d’extinction molaire (ε_M, en M⁻¹cm⁻¹) décrit l’absorbance par mole de protéine et nécessite la masse moléculaire pour convertir le résultat en concentration massique (mg/mL). Un coefficient massique (souvent noté ε(0.1 %) ou E1%₂₈₀, en (mg/mL)⁻¹cm⁻¹) décrit directement l’absorbance par unité de concentration massique et évite l’étape de conversion par la masse moléculaire. Confondre ces deux conventions — utiliser une valeur molaire dans une formule massique ou l’inverse — est une source fréquente d’erreur d’un facteur dix dans le dosage des protéines.

Pourquoi un coefficient d’extinction théorique peut être inexact

Les coefficients d’extinction molaires sont généralement calculés à partir de la séquence d’acides aminés : on dénombre les résidus de tryptophane, de tyrosine et de cystine (cystéines engagées dans des ponts disulfure), puis on additionne leurs contributions connues. Cette méthode convient à la plupart des protéines solubles correctement repliées, mais peut sous-estimer ou surestimer l’absorbance de protéines ayant un repliement inhabituel, des cofacteurs liés ou peu de résidus aromatiques. Les étiquettes de fusion, les agents dénaturants et le pH peuvent également faire varier le coefficient réel par rapport à la valeur théorique.

Quand utiliser une courbe étalon

Les dosages colorimétriques comme Bradford (liaison du colorant Coomassie) et BCA (acide bicinchoninique, réduction du cuivre) ne reposent pas sur l’absorbance UV propre à la protéine. Ils mesurent une variation de couleur proportionnelle à la masse totale de protéines, étalonnée à partir d’une courbe construite avec des concentrations connues d’une protéine de référence, généralement l’albumine sérique bovine (BSA). Moins sensibles à la composition en acides aminés d’une protéine donnée que la méthode A280, ils constituent une bonne vérification croisée — ou la méthode principale — pour les protéines pauvres en tryptophane ou en tyrosine, ainsi que pour les lysats bruts contenant plusieurs protéines différentes.

Limites des estimations fondées sur A280

La mesure A280 est rapide, mais suppose que l’échantillon ne contient pas d’autres contaminants absorbant les UV. Les acides nucléiques, en particulier, absorbent fortement à 260 nm et peuvent contribuer à la mesure à 280 nm, ce qui surestime la concentration protéique apparente. Les échantillons troubles ou contenant des particules diffusent aussi la lumière et augmentent la mesure. Pour une quantification plus rigoureuse, vérifiez l’estimation A280 avec un dosage colorimétrique (Bradford/BCA) ou, lorsque la précision absolue est essentielle, avec une analyse des acides aminés.

❓

Questions

Questions fréquentes

6 questions

Quelle est la formule de la concentration protéique à partir de A280 ?+

Avec un coefficient d’extinction molaire : C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × longueur de trajet)] × masse moléculaire. Avec un coefficient massique (sans masse moléculaire) : C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × longueur de trajet). Les deux formules découlent de la loi de Beer-Lambert, A = ε × l × c.

Pourquoi la mesure A280 renseigne-t-elle sur la concentration protéique ?+

Les acides aminés aromatiques tryptophane et tyrosine, ainsi que, plus faiblement, la phénylalanine et la cystine (ponts disulfure), absorbent fortement la lumière ultraviolette autour de 280 nanomètres. Comme l’absorbance est proportionnelle à la concentration selon la loi de Beer-Lambert, A280 permet d’estimer la quantité de protéines présente.

Quelle différence entre un coefficient d’extinction molaire et massique ?+

Un coefficient d’extinction molaire (M⁻¹cm⁻¹) exprime l’absorbance par mole de protéine ; la masse moléculaire est nécessaire pour convertir le résultat en concentration massique. Un coefficient massique ((mg/mL)⁻¹cm⁻¹, parfois noté ε(0.1 %) ou E1%₂₈₀) exprime l’absorbance par unité de masse et donne directement la concentration en mg/mL, sans masse moléculaire.

Qu’est-ce qu’une courbe étalon et quand l’utiliser ?+

Une courbe étalon est une droite d’étalonnage construite à partir de l’absorbance mesurée de plusieurs échantillons dont la concentration protéique est connue (souvent de la BSA pour un dosage Bradford ou BCA). Elle est utile si le coefficient d’extinction de la protéine est inconnu ou si l’échantillon est un mélange de protéines, comme un lysat cellulaire brut, auquel un coefficient unique ne peut pas s’appliquer.

Quelles unités ce calculateur utilise-t-il ?+

A280 et l’absorbance de la courbe étalon sont sans unité. La concentration massique est exprimée en mg/mL. Lorsque la masse moléculaire est disponible, la concentration molaire est aussi indiquée en µM (micromolaire). La masse moléculaire se saisit en daltons (Da), numériquement équivalents aux g/mol.

Comment utiliser le facteur de dilution ?+

Si l’absorbance de l’échantillon est trop élevée pour une mesure précise (généralement au-delà d’une valeur A280 d’environ 1.0–1.5), diluez-le avant la mesure, puis saisissez le facteur de dilution — par exemple 10 pour une dilution au 1:10 — dans l’onglet « À partir de A280 » ou « Dilution ». Le calculateur multiplie la concentration de l’échantillon dilué par ce facteur pour indiquer celle de la solution mère initiale, non diluée.

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