Calculez la quantité d’ADN inséré nécessaire à une réaction de ligation de clonage à partir de la quantité de vecteur et du rapport molaire insert:vecteur souhaité.
Vector and Insert
Quantité d’ADN vecteur digéré ou linéarisé utilisé dans la réaction, en nanogrammes.
Longueur du vecteur linéarisé, en paires de bases.
Longueur du fragment d’ADN à insérer, en paires de bases.
Excès molaire d’insert souhaité par rapport au vecteur — 3:1 est un point de départ courant pour les ligations à extrémités cohésives.
Exemples de réactions
Quantité d’ADN inséré
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Enter vector mass, vector/insert length, and molar ratio above to compute how much insert DNA to add.
Quantités molaires
—
Vector and insert molar amounts (pmol), length-adjusted from the mass you entered.
Résumé de la réaction
—
A summary of the vector and insert amounts to combine in the ligation reaction.
4 min de lecture3 étapes7 termes3 exemples6 questionsinsert ng = vector ng × (insert length bp / vector length bp)…
Pour réussir une ligation de clonage, il faut ajouter la bonne quantité molaire d’insert par rapport au vecteur, et pas simplement une masse arbitraire.
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Étapes
Comment utiliser cette calculatrice
3 étapes▸
1
Saisissez la masse et la longueur du vecteur
Indiquez la masse d’ADN vecteur linéarisé utilisée (en ng) et sa longueur (en paires de bases). Ces données proviennent de la digestion ou de la linéarisation par PCR, ainsi que d’une mesure de concentration au NanoDrop ou sur gel.
2
Saisissez la longueur de l’insert et le rapport molaire
Indiquez la longueur du fragment à insérer (en pb) et le rapport molaire insert:vecteur souhaité — 3:1 est un point de départ courant pour les ligations à extrémités cohésives. Le calculateur se met à jour instantanément.
3
Consultez la quantité d’insert nécessaire
L’onglet Quantité d’insert indique combien de nanogrammes ajouter ; l’onglet Rapport molaire affiche les quantités en pmol et Configuration de la réaction résume les quantités des deux ADN.
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Référence
Formule et méthodologie
1 formules▸
Masse d’insert pour un rapport molaire cible
insert ng = vector ng × (insert length bp / vector length bp) × molar ratio
Comme des fragments d’ADN de longueurs différentes n’ont pas la même masse pour une même quantité molaire, la masse d’insert nécessaire varie selon le rapport de longueur insert:vecteur et l’excès molaire souhaité. Les quantités en pmol sont calculées à partir de la masse en utilisant la masse moyenne standard de 660 g/mol par paire de bases d’ADN double brin.
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Glossaire
Termes clés expliqués
7 termes▸
LigationJonction enzymatique de deux fragments d’ADN — généralement un vecteur linéarisé et un insert — par une ADN ligase, qui forme les liaisons phosphodiester scellant les fragments.
InsertFragment d’ADN cloné dans le vecteur, par exemple un gène ou un produit de PCR. Sa longueur est saisie en paires de bases et sa masse ajoutée à la réaction.
VecteurSquelette d’ADN linéarisé (souvent un plasmide) dans lequel l’insert est ligaturé ; il apporte l’origine de réplication et le marqueur de sélection nécessaires à la propagation du construit.
Rapport molaireRapport entre les molécules d’insert et de vecteur dans la réaction, exprimé sous la forme insert:vecteur (par exemple 3:1). Un rapport plus élevé augmente les chances de ligation, mais peut accroître le bruit de fond dû à l’auto-ligation de l’insert.
ClonageProcessus consistant à insérer un fragment d’ADN dans un vecteur, à le transformer dans des bactéries et à sélectionner les colonies portant le construit attendu.
Paires de basesUnité de longueur de l’ADN double brin (pb). La longueur du vecteur et de l’insert est saisie en paires de bases, car la masse du fragment dépend directement de sa longueur.
TransformationÉtape suivant la ligation au cours de laquelle l’ADN ligaturé est introduit dans des bactéries compétentes, qui répliquent ensuite le construit et permettent sa sélection sur milieu contenant un antibiotique.
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Situations types
Exemples concrets
3 exemples▸
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Étudiant en biologie moléculaire
Rapport insert:vecteur de 3:1
Masse du vecteur (ng) 50Longueur du vecteur (pb) 3000Longueur de l’insert (pb) 1000Rapport molaire 3
Masse de l’insert = 50 × (1,000/3,000) × 3 = 50 ng. Le vecteur étant trois fois plus long que l’insert, le rapport de longueur compense le rapport molaire : la masse d’insert nécessaire est égale à celle du vecteur, un contrôle utile pour une ligation standard à extrémités cohésives au rapport 3:1.
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Étudiant en biologie moléculaire
Insert plus long, même rapport
Masse du vecteur (ng) 50Longueur du vecteur (pb) 3000Longueur de l’insert (pb) 2500Rapport molaire 3
Masse de l’insert = 50 × (2,500/3,000) × 3 = 125 ng. En gardant la même quantité de vecteur et un rapport molaire de 3:1 mais en utilisant un insert plus long (2,500 pb au lieu de 1,000 pb), la masse d’insert nécessaire fait plus que doubler, puisqu’il faut davantage d’ADN pour obtenir le même nombre de molécules.
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Étudiant en biologie moléculaire
Quantités molaires (ligation 5:1)
Masse du vecteur (ng) 100Longueur du vecteur (pb) 5000Longueur de l’insert (pb) 500Rapport molaire 5
Vecteur : 100 ng à 5,000 pb ≈ 0.030 pmol. Insert nécessaire : 50 ng à 500 pb ≈ 0.152 pmol, soit exactement 5 fois la quantité molaire du vecteur. Le rapport molaire insert:vecteur de 5:1 est ainsi respecté malgré la grande différence de longueur des fragments.
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Référence
Citer cette calculatrice
APA et MLA▸
Utilisez un de ces formats pour citer cette calculatrice dans un devoir ou un rapport.
Pour réussir une ligation de clonage, il faut ajouter la bonne quantité molaire d’insert par rapport au vecteur, et pas simplement une masse arbitraire. Ce calculateur convertit le rapport molaire insert:vecteur en nanogrammes d’ADN à pipeter, tient compte de l’effet de la longueur sur la conversion masse-moles et affiche les quantités molaires des deux fragments.
Fonctionnement du calculateur de ligation
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L’ADN ligase relie les extrémités compatibles d’un vecteur linéarisé et d’un fragment d’insert. Le nombre d’extrémités ligatables étant fixe par molécule, quelle que soit sa longueur, l’efficacité dépend du rapport molaire des molécules d’insert et de vecteur, pas de leur rapport massique. Le calculateur part de la masse et de la longueur du vecteur, calcule sa quantité molaire, puis détermine la masse d’insert nécessaire au rapport cible en utilisant le rapport de longueur insert:vecteur comme facteur d’échelle.
Les quantités molaires sont calculées à partir de la masse d’ADN avec la masse moyenne standard de 660 g/mol par paire de bases pour l’ADN double brin, constante utilisée dans les autres calculateurs de quantité d’ADN Calculover afin de conserver des résultats cohérents.
Données saisies et leur signification
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La masse du vecteur (ng) et sa longueur (pb) décrivent le squelette linéarisé mesuré au NanoDrop ou par quantification sur gel après digestion de restriction ou linéarisation par PCR. La longueur de l’insert (pb) correspond au fragment cloné. Le rapport molaire insert:vecteur indique l’excès cible de molécules d’insert : 3:1 est un point de départ habituel pour les ligations à extrémités cohésives (enzymes de restriction), tandis que les ligations à extrémités franches utilisent souvent des rapports plus élevés (5:1 à 10:1) pour compenser leur moindre efficacité.
La longueur de l’insert influence le plus la masse nécessaire : à rapport molaire identique, doubler sa longueur double approximativement la quantité d’insert en ng, car une masse supérieure est requise pour obtenir le même nombre de molécules.
Limites et cas particuliers
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Ce calculateur suppose de l’ADN double brin standard et utilise la masse moyenne courante de 660 g/mol/pb ; il ne tient pas compte des variations de contenu GC, qui modifient légèrement la masse moléculaire réelle. Les ligations à extrémités franches nécessitent généralement un rapport molaire supérieur à celui des ligations à extrémités cohésives, car elles ne disposent pas de surplombs complémentaires ; ajustez le rapport plutôt que de vous fier à une valeur par défaut unique. Pour un assemblage de plusieurs fragments (Golden Gate ou Gibson), utilisez le calculateur une fois par fragment avec la même quantité de vecteur.
❓
Questions
Questions fréquentes
6 questions▸
Quelle est la formule du calculateur de ligation ?+
Masse d’insert (ng) = masse du vecteur (ng) × (longueur de l’insert (pb) / longueur du vecteur (pb)) × rapport molaire. Le rapport de longueur ajuste la masse du vecteur à la taille de l’insert, et le rapport molaire fixe le nombre de molécules d’insert par molécule de vecteur.
Quel rapport molaire insert:vecteur dois-je utiliser ?+
Un rapport de 3:1 est un point de départ courant pour les ligations à extrémités cohésives compatibles avec les enzymes de restriction. Les ligations à extrémités franches sont généralement moins efficaces et utilisent souvent un rapport plus élevé, par exemple 5:1 à 10:1.
Pourquoi un insert plus long nécessite-t-il plus de masse d’ADN ?+
Le rapport molaire porte sur le nombre de molécules, pas sur leur masse. Une molécule d’insert plus longue pèse davantage ; pour ajouter le même nombre de molécules d’insert et atteindre le rapport molaire cible, il faut donc proportionnellement plus de nanogrammes.
Dois-je raisonner en masse (ng) ou en quantité molaire (pmol) ?+
L’efficacité de la ligation dépend du rapport molaire des molécules d’insert et de vecteur : la quantité en pmol est donc celle qui compte biologiquement. La masse en ng est mesurable et pipetable ; le calculateur convertit l’une en l’autre selon la longueur de chaque fragment.
Quelles unités utilise le calculateur de ligation ?+
Les masses du vecteur et de l’insert sont exprimées en nanogrammes (ng), leurs longueurs en paires de bases (pb) et les quantités molaires en picomoles (pmol). Le rapport molaire est sans unité, par exemple 3 pour un rapport insert:vecteur de 3:1.
Le rapport diffère-t-il entre ligations à extrémités franches et cohésives ?+
Oui. Les ligations à extrémités cohésives, qui utilisent les surplombs complémentaires issus d’une digestion de restriction, sont généralement efficaces à un rapport insert:vecteur de 3:1. Les extrémités franches ne guident pas l’appariement et sont moins efficaces ; les biologistes moléculaires utilisent donc souvent un rapport supérieur, de 5:1 à 10:1.
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