Calculez le nombre de molécules d’ADN (nombre de copies) à partir de la masse et de la longueur du fragment, convertissez-le en copies par microlitre et créez une série de dilutions pour une courbe étalon de qPCR.
Fragment
Enter the mass, length, and strandedness of your DNA fragment to calculate its molecule copy number.
Strandedness sets the average per-base(-pair) mass used in the formula.
Paires de bases (ADNdb) ou bases (ADNsb).
Masse totale d’ADN en nanogrammes, par exemple d’après une mesure au spectrophotomètre ou au Qubit.
Résultat
—
Enter a mass and length above to calculate copy number.
Sample volume
Uses the same mass, length, and type as the Copy Number tab, divided across the volume your sample is dissolved in.
Volume total dans lequel est dissoute la masse du fragment (onglet Nombre de copies).
Résultat
—
Enter a volume above to compute copies per µL.
Dilution series
Builds a serial dilution series for a qPCR standard curve, starting from the neat copies/µL concentration on the Copies per µL tab.
Facteur de dilution appliqué à chaque étape (10 est la valeur standard des courbes étalons de qPCR).
Nombre de points de la courbe étalon, y compris l’échantillon initial non dilué.
Résultat
—
Enter a volume on the Copies per µL tab to build the dilution series.
Step
Copies/µL
—
4 min de lecture4 étapes7 termes3 exemples6 questionscopies = (mass_ng × 10⁻⁹ × 6.022 × 10²³) / (length × 660)
La quantification absolue par qPCR consiste à comparer un échantillon inconnu à une courbe étalon de nombres de molécules connus, et pas seulement de masses connues.
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Étapes
Comment utiliser cette calculatrice
4 étapes▸
1
Choisissez le type, la longueur et la masse
Dans l’onglet Nombre de copies, sélectionnez l’ADN double brin (ADNdb) ou simple brin (ADNsb), saisissez la longueur du fragment en paires de bases (ou en bases pour l’ADNsb), puis indiquez sa masse en nanogrammes — par exemple, d’après une mesure Qubit ou spectrophotométrique.
2
Consultez le nombre de copies
La carte de résultat se met à jour instantanément et affiche le nombre total de molécules d’ADN en notation scientifique, calculé à partir de la masse et de la masse moyenne par paire de bases.
3
Convertissez en copies par µL
Passez à l’onglet Copies par µL et saisissez le volume dans lequel votre échantillon est dissous. Le calculateur divise le nombre total de copies obtenu à l’étape 2 par ce volume.
4
Créez une série de dilutions pour la qPCR
Dans l’onglet Standard qPCR, définissez un facteur de dilution (10 est la valeur standard) et un nombre d’étapes pour générer un tableau de dilutions en série destiné à une courbe étalon de quantification absolue par qPCR.
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Référence
Formule et méthodologie
3 formules▸
Nombre de copies à partir de la masse et de la longueur
La masse en nanogrammes est convertie en grammes, multipliée par la constante d’Avogadro (molécules par mole), puis divisée par la masse moléculaire totale du fragment (longueur × masse moyenne par paire de bases). Pour l’ADNdb, on utilise 660 g/mol par paire de bases ; pour l’ADNsb, 330 g/mol par base, car un brin simple a environ la moitié de la masse d’une paire de bases.
Copies par microlitre
copies/µL = total copies ÷ volume (µL)
Diviser le nombre total de copies par le volume dans lequel l’échantillon est dissous donne la concentration en copies par microlitre, unité généralement utilisée pour les courbes étalons de qPCR.
Série de dilutions en série pour la qPCR
Cₙ = C₁ / factor^(n-1)
À partir de la concentration initiale (non diluée) en copies/µL (C₁), chaque point suivant de la courbe étalon est dilué selon le même facteur — une dilution au dixième est la norme et réduit la concentration d’un facteur 10, soit d’un logarithme, à chaque point.
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Glossaire
Termes clés expliqués
7 termes▸
Nombre de copiesNombre total de molécules d’ADN individuelles présentes dans un échantillon, calculé à partir de sa masse et de la masse moléculaire d’une molécule à l’aide de la constante d’Avogadro.
dsDNAADN double brin. La longueur se mesure en paires de bases (pb) ; ce calculateur utilise une masse moyenne de 660 g/mol par paire de bases.
Paire de bases (pb)Deux nucléotides complémentaires (A-T ou G-C) associés sur les deux brins d’une molécule d’ADN double brin. C’est l’unité standard pour mesurer la longueur d’un fragment d’ADNdb.
Constante d’AvogadroNombre de molécules contenues dans une mole d’une substance : 6.022 × 10²³. Multiplier la quantité d’ADN en moles par cette constante donne le nombre total de molécules.
Masse moyenne par pbMasse moléculaire moyenne apportée par une paire de bases (ou par une base pour l’ADN simple brin) : environ 660 g/mol pour l’ADNdb et 330 g/mol pour l’ADNsb. Cette approximation indépendante de la séquence est courante en biologie moléculaire, même si la valeur exacte varie légèrement selon la composition en bases.
qPCRPCR quantitative (en temps réel), technique qui mesure l’amplification de l’ADN au fur et à mesure. Elle sert souvent à déterminer le nombre absolu de copies d’une séquence cible dans un échantillon inconnu en le comparant à une courbe étalon de dilutions à concentration connue.
PlasmidePetite molécule circulaire d’ADN double brin, distincte de l’ADN chromosomique, souvent utilisée pour porter un gène d’intérêt. Sa taille et sa séquence étant connues, elle sert couramment à préparer des étalons de nombre de copies pour la qPCR.
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Situations types
Exemples concrets
3 exemples▸
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Quantification d’une préparation de plasmide
Fragment d’ADNdb de 1,000 pb, masse de 100 ng
Type dsDNALongueur 1,000 bpMasse 100 ng
copies = (100 × 10⁻⁹ × 6.022 × 10²³) / (1,000 × 660) ≈ 9.12 × 10¹⁰ copies. Il s’agit du nombre total de molécules dans l’échantillon de 100 ng, avant de tenir compte du volume dans lequel il est dissous.
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Conversion en concentration de travail
Même échantillon de 100 ng, dissous dans 50 µL
Nombre total de copies ≈ 9.12 × 10¹⁰Volume 50 µL
copies/µL = 9.12 × 10¹⁰ ÷ 50 ≈ 1.82 × 10⁹ copies/µL. C’est la concentration à ajouter à une réaction de qPCR ou à utiliser comme point initial non dilué d’une courbe étalon.
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Préparation d’une courbe étalon de qPCR
Dilution au dixième, 7 points, à partir de 1.82 × 10⁹ copies/µL
Concentration initiale 1.82 × 10⁹ copies/µLFacteur de dilution 10Étapes 7
À chaque étape, la concentration précédente est divisée par 10 ; au point 7, elle atteint environ 1.82 × 10³ copies/µL. Cette plage de six ordres de grandeur est typique d’une courbe étalon de qPCR fiable.
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Référence
Citer cette calculatrice
APA et MLA▸
Utilisez un de ces formats pour citer cette calculatrice dans un devoir ou un rapport.
APA
MLA
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Analyse approfondie
De la masse aux molécules : nombre de copies d’ADN et étalons de qPCR
La quantification absolue par qPCR consiste à comparer un échantillon inconnu à une courbe étalon de nombres de molécules connus, et pas seulement de masses connues. Convertir la masse d’un fragment d’ADN en son nombre réel de copies, puis en série de dilutions, relie une mesure au spectrophotomètre ou au Qubit à une courbe étalon exploitable.
Pourquoi le nombre de copies compte davantage que la masse seule
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Deux échantillons d’ADN de même masse peuvent contenir des nombres de molécules très différents si leurs fragments n’ont pas la même longueur : un fragment de 200 pb contient bien plus de molécules par nanogramme qu’un fragment de 10,000 pb de même masse, car chaque molécule est plus légère. Pour les courbes étalons de qPCR, c’est le nombre réel de molécules (le nombre de copies) qui importe, car les valeurs Ct reflètent le nombre de copies cibles présentes et non la masse en nanogrammes. Ce calculateur convertit la masse et la longueur en nombre de copies à l’aide de la constante d’Avogadro, utilisée pour convertir toute quantité en moles en nombre de molécules.
Pourquoi l’ADNdb et l’ADNsb ont des masses moyennes différentes
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La longueur de l’ADN double brin se mesure en paires de bases ; chaque unité comptabilise déjà les deux brins complémentaires. L’approximation standard de 660 g/mol par paire de bases correspond donc à leur masse combinée. La longueur de l’ADN simple brin se mesure base par base ; sa masse moyenne (330 g/mol par base) représente environ la moitié de celle d’une paire de bases, puisqu’elle ne comprend qu’un seul brin. Choisir le mauvais type de brin pour l’échantillon produit un nombre de copies décalé d’environ un facteur deux.
Créer une série de dilutions pour une courbe étalon
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Une courbe étalon de qPCR est construite en amplifiant plusieurs dilutions de concentration connue d’une matrice de référence — souvent un plasmide linéarisé ou un produit de PCR — puis en représentant leurs valeurs Ct en fonction de log(nombre de copies). Une série de dilutions au dixième sur 6 à 8 points est courante : elle couvre plusieurs ordres de grandeur tout en limitant le nombre de réactions. Une fois la concentration initiale connue en copies/µL, chaque étalon suivant s’obtient en diluant le précédent du même facteur, ce que calcule précisément l’onglet Standard qPCR.
❓
Questions
Questions fréquentes
6 questions▸
Quelle formule utilise le calculateur de nombre de copies d’ADN ?+
copies = (masse en ng × 10⁻⁹ × constante d’Avogadro) / (longueur × masse moyenne par pb ou par base). La constante d’Avogadro vaut 6.022 × 10²³ molécules par mole. L’ADNdb utilise 660 g/mol par paire de bases ; l’ADNsb, 330 g/mol par base.
Quelle masse moyenne par paire de bases ce calculateur utilise-t-il, et pourquoi ?+
660 g/mol par paire de bases pour l’ADNdb et 330 g/mol par base pour l’ADNsb. Ces approximations indépendantes de la séquence sont couramment utilisées en biologie moléculaire ; la valeur exacte d’une séquence réelle varie légèrement (environ 650 à 660 g/mol/pb) selon sa composition en A, T, G et C.
Pourquoi utiliser une courbe étalon de qPCR ?+
La qPCR en temps réel mesure des cycles d’amplification (valeurs Ct), et non directement le nombre de molécules. Pour déterminer le nombre absolu de copies cibles dans un échantillon inconnu, on compare sa valeur Ct à une courbe étalon obtenue à partir de dilutions en série d’une matrice de référence dont le nombre de copies est connu. C’est ce que l’onglet Standard qPCR vous aide à préparer.
Quelles unités le résultat utilise-t-il ?+
L’onglet Nombre de copies indique le nombre total de molécules d’ADN (un nombre simple, présenté en notation scientifique car il est très élevé). L’onglet Copies par µL divise ce nombre par le volume de l’échantillon et donne une concentration en copies par microlitre, unité standard des courbes étalons de qPCR.
Quelle différence l’ADNsb et l’ADNdb font-ils dans ce calculateur ?+
Sélectionnez ADNsb si votre échantillon est simple brin (par exemple, un oligonucléotide synthétique ou le génome d’un virus à ADN simple brin) et saisissez sa longueur en bases plutôt qu’en paires de bases. Le calculateur utilise alors 330 g/mol par base au lieu de 660 g/mol par paire de bases, car un brin simple a environ la moitié de la masse d’une paire de bases.
Comment convertir le nombre total de copies en copies par µL ?+
Dans l’onglet Copies par µL, saisissez le volume (en microlitres) dans lequel votre ADN est dissous. Le calculateur divise le nombre total de copies de l’onglet Nombre de copies par ce volume pour obtenir la concentration en copies/µL, que vous pouvez ensuite reporter dans l’onglet Standard qPCR.
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