Proteinkonzentrationsrechner

Berechnen Sie die Proteinkonzentration aus der Absorption bei 280 nm (A280) und dem Extinktionskoeffizienten nach dem Beer-Lambert-Gesetz oder mithilfe einer Standardkurve.

Wandeln Sie mithilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes einen UV-Vis-A280-Absorptionswert in eine Proteinkonzentration um: C = A280 / (ε × l). Wählen Sie einen molaren Extinktionskoeffizienten (benötigt Molekulargewicht) oder einen massenbasierten (kein).

Lesen von A280

Absorption bei 280 nm (ohne Einheit).

Einheiten des Extinktionskoeffizienten

Extinktionskoeffizient (ε)

z.B. BSA ε280 ≈ 43.824 M⁻¹cm⁻¹.

Molekulargewicht (Da)

z.B. BSA ≈ 66.500 Da. Erforderlich für molares ε.

Pfadlänge (cm)

Die Standardweglänge einer Küvette beträgt 1 cm.

Verdünnungsfaktor

1, wenn die Probe unverdünnt abgelesen wird.

Ergebnis

—

Geben Sie die zu berechnenden Werte ein.

Konzentration—

Molar (μM)—

Wie gelesen (keine Skalierung)—

5 Min. Lesezeit 3 Schritte 7 Begriffe 3 Beispiele 6 häufig gestellte Fragen C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × l)] × MW

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Schritt für Schritt

So verwenden Sie diesen Rechner

3 Schritte

Wählen Sie einen Modus und geben Sie Ihren Messwert ein

Geben Sie auf der Registerkarte „Von A280“ den A280-Absorptionswert Ihres Spektrophotometers ein, wählen Sie, ob Ihr Extinktionskoeffizient molar (M⁻¹cm⁻¹, erfordert ein Molekulargewicht) oder massenbasiert ((mg/ml)⁻¹cm⁻¹, kein Molekulargewicht erforderlich) ist, und geben Sie den Koeffizientenwert und die Küvettenweglänge (1 cm für die meisten Instrumente) ein. Wenn Sie stattdessen mit einer Bradford- oder BCA-Standardkurve arbeiten, wechseln Sie zur Registerkarte „Standardkurve“ und geben Sie die Steigung und den Achsenabschnitt der Kurve sowie die Absorption Ihrer Probe ein.

Lesen Sie die Konzentration in mg/ml und µM ab

Die Ergebniskarte zeigt die Proteinkonzentration in mg/ml zusammen mit einer verständlichen Interpretation. Immer wenn ein Molekulargewicht verfügbar ist (immer im molaren Modus, optional im Massenmodus, wenn Sie auch eines eingeben), wird auch die molare Konzentration in µM angezeigt – nützlich für Stöchiometrie- oder Bindungsberechnungen.

Verwenden Sie die Registerkarte „Verdünnung“ für verdünnte Proben

Wenn Ihre Probe zu konzentriert war, um sie direkt ablesen zu können, verdünnen Sie sie, lesen Sie den verdünnten A280 ab und verwenden Sie dann die Registerkarte „Verdünnung“, um diesen Messwert wieder auf die Konzentration der ursprünglichen Stammlösung zu skalieren. Es zeigt sowohl den Ablesewert (was sich buchstäblich in der Küvette befindet) als auch die hochskalierte Vorratskonzentration an. Alles wird sofort aktualisiert – es gibt keine Schaltfläche zum Berechnen.

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Grundlagen

Formel und Methodik

4 Formeln

Konzentration aus A280 (molarer Extinktionskoeffizient)

C (mg/mL) = [A280 / (ε_M × l)] × MW

Das Lambert-Beersche Gesetz besagt, dass die Absorption proportional zur Konzentration und Weglänge ist: A = ε × l × c. Die Lösung nach der molaren Konzentration ergibt c (mol/L) = A280 / (ε_M × l), wobei ε_M der molare Extinktionskoeffizient in M⁻¹cm⁻¹ und l die Weglänge in cm (1 cm für eine Standardküvette) ist. Durch Multiplizieren der molaren Konzentration mit dem Molekulargewicht des Proteins (MW, in g/mol oder Da) wird mol/L in g/L umgerechnet, was numerisch identisch mit mg/ml ist – eine weitere Einheitenumrechnung ist nicht erforderlich.

Konzentration aus A280 (Massenextinktionskoeffizient)

C (mg/mL) = A280 / (ε_mass × l)

Einige veröffentlichte Extinktionskoeffizienten – oft mit ε(0,1 %) oder E1%₂₈₀ bezeichnet – werden bereits auf Massenbasis in der Einheit (mg/ml)⁻¹cm⁻¹ ausgedrückt. In diesem Fall fällt die Massenkonzentration direkt aus Beer-Lambert, ohne dass überhaupt ein Molekulargewicht erforderlich ist: C (mg/ml) = A280 / (ε_masse × l). Anschließend kann noch ein Molekulargewicht angegeben werden, um zusätzlich eine molare (µM) Konzentration anzugeben.

Standardkurve

C = (A − Achsenabschnitt) / Steigung

Eine Standardkurve (üblicherweise erstellt mit einem Bradford- oder BCA-Assay und bekannten BSA-Konzentrationen) passt eine gerade Linie, Absorption = Steigung × Konzentration + Achsenabschnitt, an eine Reihe von Standards bekannter Konzentration an. Nach der Anpassung wird die Konzentration einer unbekannten Probe anhand der gemessenen Extinktion anhand der Konzentration aufgelöst.

Verdünnungsskalierung

C_stock = C_as-read × Verdünnungsfaktor

Wird eine Probe vor der Messung verdünnt – was nötig ist, sobald die Absorption über etwa 1,0–1,5 steigt und die Linearität des Spektrophotometers nachlässt –, beschreibt die aus dem verdünnten Messwert berechnete Konzentration nur die verdünnte Probe. Multiplizieren Sie sie mit dem Verdünnungsfaktor (zum Beispiel 10 bei einer 1:10-Verdünnung), um die Konzentration der ursprünglichen, unverdünnten Stammlösung zu erhalten.

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Glossar

Wichtige Begriffe erklärt

7 Begriffe

Die in einem bestimmten Lösungsvolumen gelöste Proteinmenge, am häufigsten ausgedrückt in mg/ml (Massenkonzentration) oder µM/mol pro Liter (molare Konzentration).

Die Absorption einer Probe bei einer Wellenlänge von 280 Nanometern, dem Punkt, an dem die aromatischen Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und (schwach) Phenylalanin UV-Licht absorbieren. Es handelt sich um die standardmäßige, schnelle und zerstörungsfreie Messung zur Schätzung der Proteinkonzentration.

Eine Proportionalitätskonstante (ε), die beschreibt, wie stark eine Substanz Licht bei einer bestimmten Wellenlänge absorbiert. Für Proteine kann es auf molarer Basis (M⁻¹cm⁻¹, erfordert ein Molekulargewicht, um eine Massenkonzentration zu erhalten) oder auf Massenbasis ((mg/ml)⁻¹cm⁻¹, ergibt direkt Massenkonzentration) ausgedrückt werden.

Das physikalische Gesetz besagt, dass die Absorption direkt proportional zur Konzentration und Weglänge ist: A = ε × l × c. Es liegt jeder spektrophotometrischen Konzentrationsschätzung zugrunde, einschließlich der A280-basierten Proteinquantifizierung.

Die molare Konzentration (mol/L oder µM bei niedrigen Konzentrationen) zählt Proteinmoleküle unabhängig von ihrer Größe; Die Massenkonzentration (mg/ml) gibt die gesamte Proteinmasse an. Für die Umrechnung zwischen ihnen ist das Molekulargewicht des Proteins erforderlich: Masse = molar × MW.

Eine Kalibrierungslinie, die durch Messung der Absorption mehrerer Proben mit bekannter Proteinkonzentration (häufig BSA) und anschließender Anpassung einer Linie (Absorption vs. Konzentration) erstellt wird, um die Konzentration unbekannten Proben anhand ihrer gemessenen Absorption abzulesen.

Eine gängige Marke von Mikrovolumenspektrophotometern, die in Laboren für Molekularbiologie und Biochemie zur Messung der A280- und abgeleiteten Proteinkonzentration aus nur 1–2 µL Probe ohne herkömmliche Küvette verwendet werden.

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Beispiele

Beispiele aus der Praxis

3 Praxisbeispiele

🧫

Quantifizierung einer gereinigten Lysozympräparation

A280 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten

A280-Lesung 0.5 Extinktionskoeffizient (molar) 36000 M⁻¹cm⁻¹ Molekulargewicht 14300 Da

C = [0,5 / (36.000 × 1)] × 14.300 ≈ 0,199 mg/ml (≈13,9 µM). Der gut charakterisierte Extinktionskoeffizient von Lysozym macht A280 zu einer schnellen und zuverlässigen Möglichkeit, den Ertrag nach der Reinigung zu überprüfen.

🧪

Lesen einer unbekannten Probe anhand einer BSA-Standardkurve

Standardkurve (Bradford/BCA-Assay)

Steigung 1.2 Achsenabschnitt 0.05 Absorption (unbekannt) 0.65

C = (0,65 − 0,05) / 1,2 = 0,5 mg/ml. Bradford- und BCA-Assays basieren nicht auf dem Tryptophan-/Tyrosingehalt, daher wird für Proteine mit ungewöhnlicher Aminosäurezusammensetzung oft eine Standardkurve bevorzugt.

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Ablesen eines konzentrierten Antikörperpräparats nach der Verdünnung

Skalierung eines verdünnten A280-Messwerts

A280-Wert (verdünnt) 0.4 Extinktionskoeffizient (molar) 43824 M⁻¹cm⁻¹ Molekulargewicht 66500 Da Verdünnungsfaktor 10

Die verdünnte Probe selbst beträgt ≈0,607 mg/ml; Bei einer Verdünnung von 1:10 wurde festgestellt, dass sie innerhalb des linearen Bereichs des Geräts bleibt. Eine Skalierung mit dem Verdünnungsfaktor zeigt also, dass die unverdünnte Stammlösung ≈6,07 mg/ml beträgt.

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Quellenangabe

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Hintergrundwissen

So berechnen Sie die Proteinkonzentration anhand eines A280-Werts

5 Kapitel · 5 Min. Lesezeit

Zu den routinemäßigsten Messungen in einem Biochemie- oder Molekularbiologielabor gehört es, genau zu wissen, wie viel Protein in einer Probe enthalten ist – bevor ein Gel aufgetragen, ein Enzymtest durchgeführt oder ein Western Blot normalisiert wird. UV-Spektrophotometrie bei 280 nm macht dies schnell und zerstörungsfrei, aber um eine genaue Zahl zu erhalten, hängt es von der Wahl des richtigen Extinktionskoeffizienten und dem Verständnis ab, was das Beer-Lambert-Gesetz tatsächlich misst.

Warum A280 die Proteinkonzentration misst

Proteine absorbieren ultraviolettes Licht am stärksten um 280 Nanometer aufgrund der aromatischen Seitenketten von Tryptophan und Tyrosin (und, schwächer, Phenylalanin- und Disulfidbindungen). Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz ist die Extinktion bei einer festen Weglänge direkt proportional zur Konzentration. Mit der Messung von A280 können Sie also die Konzentration zurückrechnen, sobald Sie den Extinktionskoeffizienten der Probe kennen – die Proportionalitätskonstante, die die Extinktion mit der tatsächlich vorhandenen Proteinmenge verknüpft.

Molare vs. Massenextinktionskoeffizienten

Extinktionskoeffizienten für Proteine werden in zwei verschiedenen Konventionen veröffentlicht. Ein molarer Extinktionskoeffizient (ε_M, in M⁻¹cm⁻¹) beschreibt die Absorption pro Mol Protein und erfordert das Molekulargewicht des Proteins, um das Ergebnis in eine Massenkonzentration (mg/ml) umzuwandeln. Ein Massenextinktionskoeffizient (oft mit ε(0,1 %) oder E1 %₂₈₀ in (mg/ml)⁻¹cm⁻¹ bezeichnet) beschreibt die Absorption pro Massenkonzentrationseinheit direkt, wobei der Molekulargewichtsschritt vollständig übersprungen wird. Die Verwechslung der beiden Konventionen – das Einsetzen eines molaren Wertes in eine massenbasierte Formel oder umgekehrt – ist eine der häufigsten Ursachen für einen Größenordnungsfehler bei der Proteinquantifizierung.

Warum ein theoretischer Extinktionskoeffizient falsch sein kann

Molare Extinktionskoeffizienten werden normalerweise theoretisch aus der Aminosäuresequenz eines Proteins berechnet – indem Tryptophan-, Tyrosin- und Cystinreste (disulfidgebundenes Cystein) gezählt und ihre bekannten Beiträge pro Rest summiert werden. Dies funktioniert bei den meisten gut gefalteten, löslichen Proteinen gut, bei Proteinen mit ungewöhnlicher Faltung, gebundenen Cofaktoren oder wenigen aromatischen Resten kann die Absorption jedoch unter- oder überschätzt werden. Auch Fusionsmarkierungen, Denaturierungsmittel und der pH-Wert können den tatsächlichen Extinktionskoeffizienten vom theoretischen Wert abweichen.

Wann sollte stattdessen eine Standardkurve verwendet werden?

Kolorimetrische Tests wie Bradford (Coomassie-Farbstoffbindung) und BCA (Bicinchoninsäure, Kupferreduktion) basieren überhaupt nicht auf der eigenen UV-Absorption eines Proteins – sie messen eine Farbänderung proportional zur Gesamtproteinmasse, kalibriert anhand einer Standardkurve, die aus bekannten Konzentrationen eines Referenzproteins, normalerweise Rinderserumalbumin (BSA), erstellt wurde. Diese Methoden reagieren weniger empfindlich auf die Aminosäurezusammensetzung eines bestimmten Proteins als A280, was sie zu einer guten Gegenprüfung – oder der primären Methode – für Proteine mit wenigen Tryptophan-/Tyrosinresten oder für Rohlysate macht, die viele verschiedene Proteine gleichzeitig enthalten.

Einschränkungen von A280-basierten Schätzungen

A280-Messwerte sind schnell, es wird jedoch davon ausgegangen, dass die Probe frei von anderen UV-absorbierenden Verunreinigungen ist – insbesondere Nukleinsäuren absorbieren stark bei 260 nm und können in den 280-nm-Messwert übergehen, wodurch die scheinbare Proteinkonzentration erhöht wird. Trübe oder partikelförmige Proben streuen das Licht und erhöhen zudem den Messwert. Für die genaueste Quantifizierung vergleichen Sie eine A280-basierte Schätzung mit einem kolorimetrischen Assay (Bradford/BCA) oder, wenn absolute Genauigkeit am wichtigsten ist, einer Aminosäureanalyse.

❓

Fragen

Häufig gestellte Fragen

6 Fragen

Wie lautet die Formel zur Berechnung der Proteinkonzentration aus A280?+

Unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten: C (mg/ml) = [A280 / (ε_M × Pfadlänge)] × Molekulargewicht. Unter Verwendung eines massenbasierten Extinktionskoeffizienten (kein Molekulargewicht erforderlich): C (mg/ml) = A280 / (ε_Masse × Weglänge). Beide stammen aus dem Lambert-Beerschen Gesetz, A = ε × l × c.

Warum misst A280 die Proteinkonzentration?+

Die aromatischen Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin (und, schwächer, Phenylalanin und Cystin/Disulfid-Bindungen) absorbieren ultraviolettes Licht am stärksten um 280 Nanometer. Da die Absorption nach dem Lambert-Beerschen Gesetz proportional zur Konzentration ist, können Sie mit der Messung von A280 abschätzen, wie viel Protein vorhanden ist.

Was ist der Unterschied zwischen einem molaren und einem Massenextinktionskoeffizienten?+

Ein molarer Extinktionskoeffizient (M⁻¹cm⁻¹) ist die Absorption pro Mol Protein und erfordert die Umrechnung des Molekulargewichts in eine Massenkonzentration. Ein Massenextinktionskoeffizient ((mg/ml)⁻¹cm⁻¹, manchmal veröffentlicht als ε(0,1 %) oder E1%₂₈₀) ist die Absorption pro Massenkonzentrationseinheit und gibt mg/ml direkt an, ohne dass ein Molekulargewicht erforderlich ist.

Was ist eine Standardkurve und wann sollte ich eine verwenden?+

Eine Standardkurve ist eine Kalibrierungslinie, die aus der gemessenen Absorption mehrerer Proben mit bekannter Proteinkonzentration (üblicherweise BSA in einem Bradford- oder BCA-Assay) erstellt wird. Dies ist nützlich, wenn Sie den Extinktionskoeffizienten Ihres Proteins nicht kennen oder wenn Sie mit einer Proteinmischung (wie einem rohen Zelllysat) arbeiten, bei der ein einzelner Extinktionskoeffizient nicht gilt.

Welche Einheiten verwendet dieser Rechner?+

A280 und die Standardkurvenabsorption sind einheitenlos. Die Massenkonzentration wird in mg/ml angegeben. Die molare Konzentration wird immer dann angezeigt, wenn ein Molekulargewicht verfügbar ist, und wird in µM (Mikromolar) angegeben. Das Molekulargewicht wird in Dalton (Da) eingegeben, was numerisch g/mol entspricht.

Wie verwende ich den Verdünnungsfaktor?+

Ist die Absorption Ihrer Probe für eine genaue Messung zu hoch (typischerweise bei einem A280-Wert über etwa 1,0–1,5), verdünnen Sie die Probe vor der Messung. Geben Sie anschließend den Verdünnungsfaktor ein – zum Beispiel 10 für eine 1:10-Verdünnung – auf der Registerkarte „Von A280“ oder „Verdünnung“. Der Rechner multipliziert die Konzentration der verdünnten Probe mit diesem Faktor, um die Konzentration der ursprünglichen, unverdünnten Stammlösung anzugeben.

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