Berechnen Sie die Menge an Insert-DNA, die für eine Klonierungs-Ligationsreaktion benötigt wird, aus der Vektormenge und dem gewünschten Molverhältnis von Insert:Vektor.
Vektor und Einfügen
Menge der in der Reaktion verwendeten verdauten/linearisierten Vektor-DNA in Nanogramm.
Länge des linearisierten Vektors in Basenpaaren.
Länge des einzufügenden DNA-Fragments in Basenpaaren.
Der gewünschte molare Überschusseinsatz während des Vektors – 3:1 ist ein üblicher Ausgangspunkt für Sticky-End-Ligationen.
Beispiele für Reaktionen
DNA einfügen erforderlich
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Geben Sie oben die Vektormasse, die Vektor-/Insert-Länge und das Molverhältnis ein, um zu berechnen, wie viel Insert-DNA hinzugefügt werden muss.
Molare Mengen
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Vektoren und Molmengen (pmol) einfügen, längenangepasst von der eingegebenen Masse.
Reaktionszusammenfassung
—
Eine Zusammenfassung des Vektors und des Inserts besteht darin, sich in der Ligationsreaktion zu vereinen.
4 Min. Lesezeit3 Schritte7 Begriffe3 Beispiele6 häufig gestellte Frageninsert ng = vector ng × (insert length bp / vector length bp)…
Damit eine Klonligation zuverlässig funktioniert, muss zunächst die richtige molare Menge an Insert im Verhältnis zum Vektor hinzugefügt werden – und nicht nur eine beliebige Masse.
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Schritt für Schritt
So verwenden Sie diesen Rechner
3 Schritte▸
1
Geben Sie Vektormasse und -länge ein
Geben Sie die Masse der von Ihnen verwendeten linearisierten Vektor-DNA (in ng) und ihre Länge (in Basenpaaren) ein. Diese stammen aus Ihrem Verdauungs- oder PCR-Linearisierungs- und einem NanoDrop- oder Gel-basierten Konzentrationswert.
2
Geben Sie die Einsatzlänge und das Molverhältnis ein
Geben Sie die Länge des Insert-Fragments (in bp) und Ihr angestrebtes molares Verhältnis von Insert zu Vektor ein – 3:1 ist ein üblicher Ausgangspunkt für Ligationen mit klebrigen Enden. Der Rechner wird sofort aktualisiert.
3
Lesen Sie die benötigte Einsatzmenge ab
Auf der Registerkarte Einsatzmenge wird angezeigt, wie viele Nanogramm Einsatz hinzugefügt werden müssen. Wechseln Sie zu Molar Ratio, um die pmol-Mengen anzuzeigen, oder zu Reaction Setup, um eine kombinierte Zusammenfassung beider DNA-Mengen zu erhalten.
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Grundlagen
Formel und Methodik
1 Formel▸
Geben Sie die Masse für ein angestrebtes Molverhältnis ein
insert ng = vector ng × (insert length bp / vector length bp) × molar ratio
Da DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge bei gleicher molarer Menge unterschiedlich wiegen, skaliert die Masse des benötigten Inserts mit dem Längenverhältnis von Insert zu Vektor und dem gewünschten molaren Überschuss von Insert gegenüber Vektor. Molmengen (pmol) werden aus der Masse abgeleitet, wobei die standardmäßige durchschnittliche Masse von 660 g/mol pro Basenpaar für doppelsträngige DNA verwendet wird.
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Glossar
Wichtige Begriffe erklärt
7 Begriffe▸
Die enzymatische Verbindung zweier DNA-Fragmente – typischerweise eines linearisierten Vektors und eines Inserts – mithilfe von DNA-Ligase, die die Phosphodiesterbindungen bildet, die die Fragmente miteinander versiegeln.
Das in den Vektor klonierte DNA-Fragment, beispielsweise ein Gen oder PCR-Produkt, wird hier anhand seiner Länge in Basenpaaren und der zur Reaktion hinzugefügten Masse gemessen.
Das linearisierte DNA-Rückgrat (normalerweise ein Plasmid), in das das Insert ligiert wird, stellt den Replikationsursprung und den selektierbaren Marker bereit, der zur Vermehrung des resultierenden Konstrukts erforderlich ist.
Das Verhältnis von Insertmolekülen zu Vektormolekülen in der Ligationsreaktion, ausgedrückt als Insert:Vektor (z. B. 3:1). Höhere Verhältnisse erhöhen die Chance auf eine erfolgreiche Ligation, können jedoch den Hintergrund der Insert-Selbstligatur erhöhen.
Der Gesamtprozess des Einfügens eines DNA-Fragments in einen Vektor, seiner Umwandlung in Bakterien und der Auswahl von Kolonien, die das richtige Konstrukt tragen.
Die Einheit zur Messung der Länge doppelsträngiger DNA (bp). Sowohl die Vektor- als auch die Insertlänge werden in Basenpaaren eingegeben, da die Fragmentmasse direkt mit der Länge skaliert.
Der Schritt nach der Ligation, bei dem die ligierte DNA in kompetente Bakterienzellen eingeführt wird, die dann das Konstrukt replizieren und seine Selektion auf Antibiotikaplatten ermöglichen.
Einfügen ng = 50 × (1000/3000) × 3 = 50 ng. Wenn ein Vektor ein Drittel der Länge des Inserts beträgt und der Längenverhältnisterm gegenüber dem Molverhältnis aufgehoben wird, entspricht die benötigte Insertmasse zufällig der Vektormasse – eine nützliche Plausibilitätsprüfung für eine standardmäßige 3:1-Sticky-End-Ligation.
Einfügen ng = 50 × (2500/3000) × 3 = 125 ng. Wenn man die gleiche Vektormenge und das gleiche Molverhältnis von 3:1 beibehält, aber ein längeres Insert (2500 bp statt 1000 bp) verwendet, verdoppelt sich die erforderliche Insertmasse mehr als, da mehr DNA-Masse erforderlich ist, um bei größerer Länge die gleiche molare Menge zu erreichen.
Vektor: 100 ng bei 5000 bp ≈ 0,030 pmol. Benötigtes Insert: 50 ng bei 500 bp ≈ 0,152 pmol – genau das Fünffache der molaren Menge des Vektors, was das molare Verhältnis Insert:Vektor von 5:1 unabhängig von den sehr unterschiedlichen Fragmentlängen bestätigt.
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Quellenangabe
Diesen Rechner zitieren
APA und MLA▸
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Damit eine Klonligation zuverlässig funktioniert, muss zunächst die richtige molare Menge an Insert im Verhältnis zum Vektor hinzugefügt werden – und nicht nur eine beliebige Masse. Dieser Rechner wandelt ein angestrebtes molares Verhältnis von Insert zu Vektor in die tatsächlich zu pipettierenden DNA-Inserts in Nanogramm um, wobei berücksichtigt wird, wie sich die Fragmentlänge auf die Umwandlung von Masse in Mol auswirkt, und zeigt die zugrunde liegenden molaren Mengen für beide DNA-Stücke an.
So funktioniert der Ligationsrechner
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DNA-Ligase verbindet kompatible Enden eines linearisierten Vektors und eines Insert-Fragments. Da die Anzahl der ligierbaren Enden pro Molekül unabhängig von der Länge festgelegt ist, hängt die Ligationseffizienz vom Molverhältnis von Insert- zu Vektormolekülen ab – nicht von ihrem Massenverhältnis. Dieser Rechner geht von der Masse und Länge Ihres Vektors aus, berechnet die molare Menge des Vektors und ermittelt dann, wie viel Insert-Masse erforderlich ist, um Ihr angestrebtes molares Verhältnis zu erreichen, indem er das Verhältnis von Insert zu Vektorlänge als Skalierungsfaktor verwendet.
Molmengen werden aus der DNA-Masse abgeleitet, wobei die standardmäßige durchschnittliche Masse von 660 g/mol pro Basenpaar für doppelsträngige DNA verwendet wird, dieselbe Konstante, die auch in den anderen DNA-Mengenrechnern von Calculover verwendet wird (z. B. DNA-Kopienzahl), damit die Ergebnisse erhalten bleiben konsistent.
Eingaben und was sie bedeuten
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Vektormasse (ng) und Vektorlänge (bp) beschreiben das linearisierte Rückgrat, das Sie mit NanoDrop oder Gelquantifizierung nach Restriktionsverdau oder PCR-Linearisierung gemessen haben. Die Insertlänge (bp) ist die Größe des Fragments, in das kloniert wird. Das molare Verhältnis von Insert zu Vektor ist der angestrebte Überschuss von Insertmolekülen gegenüber Vektormolekülen – 3:1 ist ein typischer Ausgangspunkt für Ligationen mit klebrigen Enden (Restriktionsenzyme), während Ligationen mit stumpfen Enden häufig höhere Verhältnisse (5:1 bis 10:1) verwenden, um die geringere Effizienz auszugleichen.
Die Insertlänge hat den größten Einfluss auf die erforderliche Masse: Verdoppelung des Inserts Die Länge verdoppelt ungefähr die ng des Einsatzes, die bei demselben Molverhältnis benötigt werden, da mehr Masse erforderlich ist, um die gleiche Anzahl an Molekülen zu erreichen.
Grenzen und Randfälle
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Dieser Rechner geht von doppelsträngiger Standard-DNA und der weit verbreiteten durchschnittlichen Masse von 660 g/mol/bp aus – er berücksichtigt nicht die Variation des GC-Gehalts, die das tatsächliche Molekulargewicht leicht verschiebt. Blunt-End-Ligationen erfordern typischerweise ein höheres Molverhältnis als Sticky-End-Ligationen, um die gleiche Effizienz zu erreichen, da ihnen komplementäre Überhänge fehlen; Passen Sie die Verhältniseingabe entsprechend an, anstatt sich auf einen einzigen Standardwert zu verlassen. Für Baugruppen mit mehreren Fragmenten (Golden Gate oder Gibson) mit mehr als einer Einfügung führen Sie diesen Rechner einmal pro Fragment gegen denselben Vektorbetrag aus.
❓
Fragen
Häufig gestellte Fragen
6 Fragen▸
Wie lautet die Formel des Ligationsrechners?+
Einfügen ng = Vektor ng × (Einfügelänge bp / Vektorlänge bp) × Molverhältnis. Das Verhältnis von Insert zu Vektorlänge skaliert die Vektormasse, um die Größe des Inserts zu berücksichtigen, und das Molverhältnis legt fest, wie viele Insert-Moleküle Sie pro Vektormolekül benötigen.
Welches molare Verhältnis von Einsatz zu Vektor sollte ich verwenden?+
3:1 ist ein üblicher Ausgangspunkt für Sticky-End-Ligationen (Restriktionsenzym-kompatibler Überhang). Blunt-End-Ligationen sind im Allgemeinen weniger effizient und verwenden häufig ein höheres Verhältnis, z. B. 5:1 bis 10:1, um die Chance auf eine erfolgreiche Ligation zu verbessern.
Warum benötigt ein längerer Einsatz mehr DNA pro Masse?+
Beim Molverhältnis geht es um die Anzahl der Moleküle, nicht um deren Masse. Ein längeres Insert-Fragment wiegt mehr pro Molekül. Um also die gleiche Anzahl an Insert-Molekülen hinzuzufügen (und das angestrebte molare Verhältnis zu erreichen), benötigen Sie proportional mehr Nanogramm Insert-DNA.
Sollte ich in Masse (ng) oder molarer Menge (pmol) denken?+
Die Ligationseffizienz hängt vom molaren Verhältnis von Insert- zu Vektormolekülen ab, sodass die molare Menge (pmol) die Menge ist, die biologisch tatsächlich von Bedeutung ist. Masse (ng) ist das, was Sie messen und pipettieren können. Daher rechnet dieser Rechner zwischen beiden um, indem er die Länge jedes Fragments verwendet.
Welche Einheiten verwendet der Ligationsrechner?+
Vektormasse und Einfügungsmasse werden in Nanogramm (ng) angegeben. Vektor- und Insertlängen sind in Basenpaaren (bp) angegeben. Molmengen werden in Pikomol (pmol) angegeben. Das Molverhältnis selbst ist eine dimensionslose Zahl, z. B. 3 für ein Insert:Vektor-Verhältnis von 3:1.
Unterscheidet sich das Verhältnis zwischen Blunt-End- und Sticky-End-Ligationen?+
Ja. Sticky-End-Ligationen, die auf komplementären Überhängen aus der Restriktionsverdauung beruhen, sind im Allgemeinen bei einem Insert:Vektor-Verhältnis von 3:1 effizient. Blunt-End-Ligationen haben keine Überhänge zur Steuerung des Annealings und sind weniger effizient, daher verwenden Molekularbiologen zum Ausgleich üblicherweise ein höheres Verhältnis – oft 5:1 bis 10:1.
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