Berechnen Sie die Anzahl der DNA-Moleküle (Kopienzahl) aus der Masse und Länge eines Fragments, rechnen Sie sie dann in Kopien pro Mikroliter um und erstellen Sie eine qPCR-Standardverdünnungsreihe.
Fragment
Geben Sie die Masse, Länge und Strangzahl Ihres DNA-Fragments ein, um die Kopienzahl seines Moleküls zu berechnen.
Strandedness legt die durchschnittliche Masse pro Base(-paar) fest, die in der Formel verwendet wird.
Basenpaare (dsDNA) oder Basen (ssDNA).
Gesamt-DNA-Masse in Nanogramm, z.B. eines Spektralfotometers oder einer Qubit-Messung.
Ergebnis
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Geben Sie oben eine Masse und eine Länge ein, um die Kopienzahl zu berechnen.
Probenvolumen
Verwendet dieselbe Masse, Länge und denselben Typ wie die Registerkarte „Kopienzahl“, aufgeteilt auf das Volumen, in dem Ihre Probe gelöst ist.
Gesamtvolumen, in das die Masse des Fragments (aus der Registerkarte „Kopienzahl“) aufgelöst wird.
Ergebnis
—
Geben Sie oben ein Volumen ein, um Kopien pro µL zu berechnen.
Verdünnungsreihe
Erstellt eine serielle Verdünnungsreihe für eine qPCR-Standardkurve, beginnend mit der Konzentration der reinen Kopien/µL auf der Registerkarte „Kopien pro µL“.
Bei jedem Schritt wird eine fache Verdünnung angewendet (10 ist der Standard für qPCR-Standardkurven).
Anzahl der Standardkurvenpunkte, einschließlich des reinen (unverdünnten) Bestands.
Ergebnis
—
Geben Sie auf der Registerkarte „Kopien pro µL“ ein Volumen ein, um die Verdünnungsreihe zu erstellen.
Die absolute Quantifizierung durch qPCR hängt vom Vergleich einer unbekannten Probe mit einer Standardkurve bekannter Molekülzahlen und nicht nur der bekannten Masse ab.
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Schritt für Schritt
So verwenden Sie diesen Rechner
4 Schritte▸
1
Wählen Sie Typ, Länge und Masse
Wählen Sie auf der Registerkarte „Kopienzahl“ die Option „dsDNA“ oder „ssDNA“ aus, geben Sie die Fragmentlänge in Basenpaaren (oder Basen für ssDNA) und die Masse in Nanogramm ein – beispielsweise aus einem Qubit- oder Spektrophotometer-Messwert.
2
Lesen Sie die Exemplarnummer
Die Ergebniskarte wird sofort aktualisiert und zeigt die Gesamtzahl der DNA-Moleküle in wissenschaftlicher Schreibweise an, berechnet aus der Masse und der durchschnittlichen Masse pro Basenpaar.
3
In Kopien pro µL umrechnen
Wechseln Sie zur Registerkarte „Kopien pro µL“ und geben Sie das Volumen ein, in dem Ihre Probe gelöst ist. Der Rechner dividiert die Gesamtkopienzahl aus Schritt 2 durch dieses Volumen.
4
Erstellen Sie eine qPCR-Verdünnungsreihe
Legen Sie auf der Registerkarte „qPCR-Standard“ einen Verdünnungsfaktor (10 ist Standard) und eine Reihe von Schritten fest, um eine serielle Verdünnungstabelle für eine qPCR-Standardkurve zur absoluten Quantifizierung zu erstellen.
Die Masse in Nanogramm wird in Gramm umgerechnet, mit der Avogadro-Zahl (Moleküle pro Mol) multipliziert und durch das Gesamtmolekulargewicht des Fragments (Länge × durchschnittliche Masse pro Basenpaar) dividiert. dsDNA verbraucht 660 g/mol pro Basenpaar; ssDNA verbraucht 330 g/mol pro Base, da ein einzelner Strang etwa die Hälfte der Masse eines Basenpaars hat.
Kopien pro Mikroliter
Kopien/µL = Gesamtzahl der Kopien ÷ Volumen (µL)
Wenn man die Gesamtkopienzahl durch das Volumen dividiert, in dem die Probe gelöst ist, erhält man die Konzentration in Kopien pro Mikroliter – die Einheit, in der qPCR-Standardkurven normalerweise ausgedrückt werden.
qPCR-Reihenverdünnungsreihe
Cₙ = C₁ / factor^(n-1)
Ausgehend von der reinen (unverdünnten) Kopien/µL-Konzentration (C₁) wird jeder nachfolgende Standardkurvenpunkt um denselben Faltfaktor verdünnt – 10-fach ist der Standard, was bedeutet, dass jeder Punkt eine logarithmisch niedrigere Konzentration als der letzte hat.
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Glossar
Wichtige Begriffe erklärt
7 Begriffe▸
Die Gesamtzahl der einzelnen DNA-Moleküle in einer Probe, berechnet aus ihrer Masse und dem Molekulargewicht eines einzelnen Moleküls unter Verwendung der Avogadro-Zahl.
Doppelsträngige DNA. Die Länge wird in Basenpaaren (bp) gemessen; Dieser Rechner geht von einer durchschnittlichen Masse von 660 g/mol pro Basenpaar aus.
Zwei komplementäre Nukleotide (A-T oder G-C), die über die beiden Stränge doppelsträngiger DNA verbunden sind – die Standardeinheit zur Messung der Länge von dsDNA-Fragmenten.
Die Anzahl der Moleküle in einem Mol einer Substanz beträgt 6,022 × 10²³. Durch Multiplizieren der DNA-Mole mit dieser Konstante erhält man die Gesamtzahl der Moleküle.
Das mittlere Molekulargewicht, das ein Basenpaar (oder bei einzelsträngiger DNA eine Base) beisteuert, beträgt etwa 660 g/mol für dsDNA und 330 g/mol für ssDNA. Diese sequenzunabhängige Näherung ist in der gesamten Molekularbiologie Standard, obwohl der genaue Wert je nach Basenzusammensetzung leicht variiert.
Quantitative (Echtzeit-)PCR – eine Technik, die die DNA-Amplifikation während ihres Geschehens misst und häufig verwendet wird, um die absolute Kopienzahl einer Zielsequenz in einer unbekannten Probe durch Vergleich mit einer Standardkurve von Verdünnungen bekannter Konzentration zu bestimmen.
Ein kleines, kreisförmiges, doppelsträngiges DNA-Molekül, das von der chromosomalen DNA getrennt ist und üblicherweise als Träger eines Gens von Interesse verwendet wird. Es wird häufig zur Herstellung von qPCR-Kopienzahlstandards verwendet, da seine genaue Größe und Sequenz bekannt sind.
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Beispiele
Beispiele aus der Praxis
3 Praxisbeispiele▸
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Quantifizierung einer Plasmidpräparation
100 ng eines 1.000 bp großen dsDNA-Fragments
Typ dsDNALänge 1.000 bpMesse 100 ng
Kopien = (100 × 10⁻⁹ × 6,022 × 10²³) / (1.000 × 660) ≈ 9,12 × 10¹⁰ Kopien. Dies ist die Gesamtzahl der Moleküle in der gesamten 100-ng-Probe, vor Berücksichtigung des gelösten Volumens.
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Umstellung auf eine Arbeitskonzentration
Dieselbe 100-ng-Probe, gelöst in 50 µL
Gesamtexemplare ≈ 9,12 × 10¹⁰Lautstärke 50 µL
Kopien/µL = 9,12 × 10¹⁰ ÷ 50 ≈ 1,82 × 10⁹ Kopien/µL. Diese Konzentration würden Sie in eine qPCR-Reaktion laden oder als reinen Punkt einer Standardkurve verwenden.
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Erstellen einer qPCR-Standardkurve
10-fache Verdünnungsreihe, 7 Punkte, beginnend mit 1,82 × 10⁹ Kopien/µL
Jeder Schritt dividiert die vorherige Konzentration durch 10 und endet bei ≈ 1,82 × 10³ Kopien/µL bei Punkt 7 – eine Sechs-Log-Spanne, die typisch für die Erstellung einer zuverlässigen qPCR-Standardkurve ist.
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Quellenangabe
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APA und MLA▸
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Hintergrundwissen
Von der Masse zu Molekülen: DNA-Kopienzahl und qPCR-Standards
Die absolute Quantifizierung durch qPCR hängt vom Vergleich einer unbekannten Probe mit einer Standardkurve bekannter Molekülzahlen und nicht nur der bekannten Masse ab. Die Umrechnung der Masse eines DNA-Fragments in seine tatsächliche Kopienzahl – und dann in eine Verdünnungsreihe – ist die Berechnung, die einen Spektrophotometer- oder Qubit-Messwert mit einer verwendbaren Standardkurve verbindet.
Warum die Anzahl der Kopien wichtiger ist als die Masse allein
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Zwei DNA-Proben mit der gleichen Masse können eine sehr unterschiedliche Anzahl von Molekülen enthalten, wenn ihre Fragmentlängen unterschiedlich sind – ein kurzes 200-bp-Fragment hat weit mehr Moleküle pro Nanogramm als ein 10.000-bp-Fragment mit der gleichen Masse, da jedes einzelne Molekül weniger wiegt. Bei qPCR-Standardkurven kommt es auf die tatsächliche Molekülzahl (Kopienzahl) an, da die Ct-Werte angeben, wie viele Zielkopien vorhanden sind, nicht wie viele Nanogramm. Dieser Rechner rechnet Masse und Länge mithilfe der Avogadro-Zahl, der gleichen Konstante, die für jede Mol-zu-Molekül-Umrechnung in der Chemie verwendet wird, in die Kopienzahl um.
Warum dsDNA und ssDNA unterschiedliche Durchschnittsmassen verwenden
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Die Länge doppelsträngiger DNA wird in Basenpaaren gemessen, wobei jede Einheit bereits für beide komplementären Stränge verantwortlich ist, sodass die Standardnäherung von 660 g/mol pro Basenpaar die kombinierte Masse beider Stränge widerspiegelt. Die Länge einzelsträngiger DNA wird pro einzelner Base gemessen, sodass ihre durchschnittliche Masse (330 g/mol pro Base) etwa halb so groß ist wie die eines Basenpaars – es ist die Masse nur eines Nukleotidstrangs. Die Verwendung der falschen Strandedness-Einstellung für Ihren Probentyp führt zu einer Kopienzahl, die etwa um den Faktor zwei abweicht.
Erstellen einer seriellen Verdünnungsreihe für eine Standardkurve
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Eine qPCR-Standardkurve wird erstellt, indem mehrere Verdünnungen einer Referenzvorlage mit bekannter Konzentration – häufig ein linearisiertes Plasmid oder PCR-Produkt – amplifiziert und ihre Ct-Werte gegen log (Kopienzahl) aufgetragen werden. Eine 10-fache Reihenverdünnung über 6–8 Punkte ist die herkömmliche Wahl, da sie mehrere Größenordnungen abdeckt und gleichzeitig die Anzahl der Reaktionen überschaubar hält. Sobald Sie die reine Konzentration in Kopien/µL kennen, ist jeder nachfolgende Standard einfach der vorherige, verdünnt um denselben Faktor, was genau das ist, was auf der Registerkarte „qPCR-Standard“ berechnet wird.
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Fragen
Häufig gestellte Fragen
6 Fragen▸
Welche Formel verwendet der DNA-Kopienzahl-Rechner?+
Kopien = (Masse in ng × 10⁻⁹ × Avogadro-Zahl) / (Länge × durchschnittliche Masse pro bp oder Base). Die Avogadro-Zahl beträgt 6,022 × 10²³ Moleküle pro Mol. dsDNA verbraucht 660 g/mol pro Basenpaar; ssDNA verbraucht 330 g/mol pro Base.
Welche durchschnittliche Masse pro Basenpaar verwendet dieser Rechner und warum?+
660 g/mol pro Basenpaar für dsDNA und 330 g/mol pro Base für ssDNA. Hierbei handelt es sich um standardmäßige sequenzunabhängige Näherungen, die in der gesamten Molekularbiologie verwendet werden. Der genaue Wert für eine reale Sequenz variiert geringfügig (ungefähr 650–660 g/mol/bp), abhängig von der genauen A/T/G/C-Zusammensetzung.
Warum sollte ich überhaupt eine qPCR-Standardkurve benötigen?+
Echtzeit-qPCR misst Amplifikationszyklen (Ct-Werte), nicht direkt die Anzahl der Moleküle. Um die absolute Anzahl der Zielkopien in einer unbekannten Probe zu bestimmen, vergleichen Sie deren Ct-Wert mit einer Standardkurve, die aus Reihenverdünnungen einer Referenzvorlage mit bekannten Kopienzahlen erstellt wurde – genau das ist es, was Ihnen die Registerkarte „qPCR-Standard“ bei der Erstellung hilft.
Welche Einheiten verwendet das Ergebnis?+
Auf der Registerkarte „Kopienzahl“ wird die Gesamtzahl der DNA-Moleküle angezeigt (eine einfache Zählung, die in wissenschaftlicher Notation angezeigt wird, da die Zahlen sehr groß sind). Auf der Registerkarte „Kopien pro µL“ wird die gleiche Anzahl dividiert durch Ihr Probenvolumen in Kopien pro Mikroliter angezeigt – der Standardeinheit für qPCR-Standardkurvenkonzentrationen.
Wie unterscheidet sich ssDNA von dsDNA in diesem Rechner?+
Wählen Sie ssDNA, wenn Ihre Probe einzelsträngig ist (z. B. ein synthetisches Oligo- oder ssDNA-Virusgenom) und geben Sie die Länge in Basen statt in Basenpaaren ein. Der Rechner verwendet dann 330 g/mol pro Base statt 660 g/mol pro Basenpaar, da ein einzelner Strang etwa die Hälfte der Masse eines Basenpaars trägt.
Wie rechne ich meine Gesamtkopienzahl in Kopien pro µL um?+
Geben Sie auf der Registerkarte „Kopien pro µL“ das Volumen ein, in dem Ihre DNA gelöst ist (in Mikrolitern). Der Rechner dividiert die Gesamtkopienzahl aus der Registerkarte „Kopienzahl“ durch dieses Volumen, um die Konzentration in Kopien/µL zu erhalten, die Sie dann in die Registerkarte „qPCR-Standard“ übernehmen können.
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