DNA-Konzentrationsrechner

DNA und RNA absorbieren ultraviolettes Licht am stärksten bei etwa 260 Nanometern, hauptsächlich aufgrund der aromatischen Ringe in ihren Nukleotidbasen. Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz ist die Absorption für eine feste Weglänge direkt proportional zur Konzentration, sodass ein Spektrophotometer-Messwert bei 260 nm (A260) in eine Konzentration umgewandelt werden kann, sobald Sie die richtige Proportionalitätskonstante für die Art der Nukleinsäure kennen, die Sie messen.

Der Umrechnungsfaktor – 50 µg/ml pro A260-Einheit für doppelsträngige DNA, 33 µg/ml für einzelsträngige DNA und 40 µg/ml für RNA – ist unterschiedlich, da diese Moleküle 260-nm-Licht pro Masseneinheit etwas unterschiedlich absorbieren. Die Doppelhelix-Basenstapelung in dsDNA verringert deren Absorption im Vergleich zu unstrukturierten Einzelsträngen etwas, weshalb ssDNA und RNA (beide in Lösung typischerweise weniger Basenpaare aufweisen) niedrigere Massenfaktoren aufweisen. Die Verwendung des falschen Faktors für Ihren Probentyp ist eine der häufigsten Ursachen für eine ungenaue Konzentrationsschätzung.

Proteine absorbieren UV-Licht aufgrund aromatischer Aminosäuren wie Tryptophan und Tyrosin am stärksten bei etwa 280 nm, während Nukleinsäuren bei 260 nm am stärksten absorbieren. Der Vergleich der beiden Absorptionen (A260/A280) ermöglicht daher eine schnelle Abschätzung, wie viel Proteinverunreinigung in einer extrahierten Probe verbleibt. Ein Verhältnis nahe 1,8 gilt als reine doppelsträngige DNA; ein Verhältnis nahe 2,0 gilt als reine RNA. Deutlich unter diesen Werten liegende Verhältnisse weisen in der Regel auf Protein- oder Phenolreste aus dem Extraktionsprozess hin, während deutlich darüber liegende Verhältnisse auf eine RNA-Kontamination in einer DNA-Präparation oder einer abgebauten Probe hinweisen können.

Spektralphotometer-Absorptionsmesswerte sind nur bei Konzentrationen bis etwa einem A260 von 1,0–2,0 zuverlässig linear, je nach Instrument. Proben mit einer höheren Konzentration sollten vor dem Ablesen verdünnt werden. Anschließend wird die berechnete Konzentration des verdünnten Messwerts mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert, um die Konzentration des Originalbestands wiederherzustellen – und genau das automatisiert die Registerkarte „Verdünnung“ dieses Rechners.

A260/A280-basierte Schätzungen sind schnell und bequem, aber weniger präzise als fluoreszenzbasierte Quantifizierungsmethoden (wie PicoGreen- oder Qubit-Assays), die spezifisch doppelsträngige DNA binden und weitaus weniger empfindlich gegenüber kontaminierender RNA, freien Nukleotiden oder Proteinen sind. Bei Anwendungen mit strengen Quantifizierungsanforderungen – wie der Vorbereitung von Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation – bestätigen Labore häufig eine NanoDrop-basierte Schätzung mit einem fluoreszenzbasierten Assay, bevor sie fortfahren.